[发明专利]一种用于检测胶基型嚼烟对细菌回复突变数影响的方法

说明书

本发明涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细菌回复突变数影响的方法，属于烟草及烟草制品安全性生物学评价技术领域。该方法包括样品前处理、增菌培养、受试菌浓度确定、S9混合液的配制、受试物的制备、受试物的培养、结果判定等步骤。本发明综合考察胶基型嚼烟的溶出方式、暴露途径、作用方式，建立了胶基型嚼烟样品前处理方法并制定了样品检测剂量，形成了适合胶基型嚼烟的细菌回复突变试验检测方法，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品安全性生物学评价技术领域，具体涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细菌回复突变数影响的方法。

背景技术

现今，化学物质及其污染物对人体的潜在危害越来越受到社会的普遍关注与重视。B.N.Ames等于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)被世界各国及组织广为采用，是目前国际公认的检测新药、食品添加剂、食品包装材料及化妆品等的致突变性、致癌性的首选试验。国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织于2002年成立了卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过工作组大量的文献调研及研究工作，该工作组推荐采用细菌回复突变试验(Ames试验)对卷烟烟气冷凝物潜在的致突变性进行检测。该检测方法目前已经被国内外烟草公司广泛采用。

烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品。口含烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。根据产品的组分及形态特点，口含烟制品分为传统含烟叶原料的Snus型口含烟和不含烟叶原料的新型口含烟(如胶基型嚼烟)。胶基型嚼烟是一种以烟草或烟草提取物为有效组分，以可食用胶基为载体，通过咀嚼方式向人体递送烟碱的新型烟草制品。咀嚼过程中烟草或烟草提取物及其他食品添加剂缓慢释放到唾液中，其释放方式有别于传统卷烟和含烟叶原料的Snus型口含烟，因此，有必要针对胶基型嚼烟自身特点建立适合胶基型嚼烟的细菌回复突变试验检测方法，确保产品的安全性。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，评价胶基型嚼烟的安全性，提供一种胶基型嚼烟细菌回复突变的检测方法，该方法是在传统卷烟制品细菌回复突变实验方法的基础上改进得到的一种适合于胶基型嚼烟致突变性检测的细菌回复突变试验方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于检测胶基型嚼烟对细菌回复突变数影响的方法，包括如下步骤：

步骤(1)，样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10％，得到待测液；

步骤(2)，增菌培养：取无菌营养肉汤培养基，将TA98和TA100菌株分别接种于营养肉汤培养基内，于37℃下振荡培养，得菌液；

步骤(3)，受试菌浓度确定：用紫外分光光度计测定步骤(2)的菌液在600nm下的OD值，再用无菌营养肉汤培养基将菌液稀释至OD值为0.3，得到检测用菌液；

步骤(4)，S9混合液的配制：制备体积百分浓度为10％的S9混合液备用；

步骤(5)，受试物的制备：受试物分为四个体系：TA98(+S9)、TA98(-S9)、TA100(+S9)和TA100(-S9)，每个体系均分为四组，自发回变组、溶剂对照组、阳性对照组和样品测试组；

其中，每个体系的样品测试组的受试物的制备方法为：在不同的培养皿内加入PBS和不同剂量的步骤(1)所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为12.5％、25％、50％、100％，得到四个浓度的样品测试组的受试物，终体积为1000μl/皿；

每个体系的自发回变组的受试物为空白；