[发明专利]一种检测胶基型嚼烟对细胞早期凋亡影响的方法

说明书

本发明涉及一种检测胶基型嚼烟对细胞早期凋亡影响的方法，属于烟草及烟草制品安全性生物学评价技术领域。该方法包括样品前处理、单细胞悬液的制备、单细胞悬浮液的细胞浓度计算、受试物暴露、孵育受试物、收集细胞、洗涤细胞、细胞早期凋亡影响率的计算等步骤。本发明综合考察胶基型嚼烟的溶出方式、暴露途径，建立了胶基型嚼烟样品前处理方法，对样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测胶基型嚼烟对细胞早期凋亡的影响。

技术领域

本发明属于烟草及烟草制品安全性生物学评价技术领域，具体涉及一种检测胶基型嚼烟对细胞早期凋亡影响的方法。

背景技术

烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品。口含烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。根据产品的组分及形态特点，口含烟制品分为传统含烟叶原料的Snus型口含烟和不含烟叶原料的新型口含烟（如胶基型嚼烟）。胶基型嚼烟是一种以烟草或烟草提取物为有效组分，以可食用胶基为载体，通过咀嚼方式向人体递送烟碱的新型烟草制品。咀嚼过程中烟草或烟草提取物及其他食品添加剂缓慢释放到唾液中，其释放方式有别于传统卷烟和含烟叶原料的Snus型口含烟。

对于卷烟细胞毒性的检测，目前通常采用中性红细胞毒性法，但存在一定的缺陷。中性红进入细胞并在细胞内聚集的过程要求有完整的细胞膜，而细胞凋亡早期细胞膜表面发生改变，带负电荷的磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。这种改变可能会影响中性红细胞毒性法的检测结果。细胞凋亡的概念是1972年由Kerr等三位科学家首次提出（Kerr JF,Wyllie AH,Currie AR. Apoptosis:a basicbiological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics.Br Jancer,1972,26:239–257.），虽然细胞凋亡（apoptosis）与细胞坏死（necrosis）的最终结果极为相似，但它们的过程与表现却有很大差别。细胞凋亡是一个主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。因此，有必要开发一种用于检测胶基型嚼烟对细胞早期凋亡影响的方法，作为胶基型嚼烟细胞毒性检测的补充方法以区别制品对细胞坏死和凋亡的影响。

发明内容

本发明的目的正是针对上述技术问题，对胶基型嚼烟细胞早期凋亡影响的流式检测法进行了综合研究，确定了胶基型嚼烟的检测剂量，以及胶基型嚼烟前处理方法，制定了一种适用于检测胶基型嚼烟对细胞早期凋亡影响的流式检测法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种检测胶基型嚼烟对细胞早期凋亡影响的方法，包括如下步骤：

步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；

步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO₂培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm²生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；

步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；