[发明专利]发酵法生产酪氨酸的大肠杆菌及其构建方法与应用

说明书

本方法公开了一株生产酪氨酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。其通过在产3‑脱氢莽草酸(DHS)的大肠杆菌中调控3‑脱氢莽草酸脱氢酶AroE，定点突变调控预苯酸脱氢酶基因TyrA，邻氨基苯甲酸合酶TrpE和预苯酸脱水酶PheA，酪氨酸转氨酶TyrB以及莽草酸途径中莽草酸激酶AroK和AroL，5‑烯醇式丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合酶AroA，分支酸合酶AroC的表达与酶活，获得酪氨酸生产能力大幅度提高的重组大肠杆菌TYR042。本发明所构建的大肠杆菌基因工程菌TYR042利用无机盐培养基，发酵糖质原料可生产45g/L的酪氨酸，具有工业化发酵生产酪氨酸的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到生产酪氨酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

芳香族氨基酸(aromatic amino acids)作为芳香族化学品的重要前体物质，拥有着可观的工业价值，通过对不同芳香族氨基酸的衍生转化，可以合成很多不同应用前景的芳香族化学品。酪氨酸作为一种芳香族氨基酸，有着广泛的应用。

酪氨酸(L-Tyrosine)一方面自身能被用作食品添加剂，文献报道指出酪氨酸能够提高大脑活性从而改善记忆力，同时能够控制食欲来控制焦躁和抑郁等。除此之外，对于患有苯丙酮尿症的患者，由于这类病人缺少将苯丙氨酸转化为酪氨酸的酶，因此酪氨酸是他们必须的饮食补充成分。另一方面，酪氨酸也是一些高附加值化合物的重要前体物质。例如，酪氨酸是合成左旋多巴(L-DOPA)的前体，左旋多巴如今是治疗帕金森疾病的最有效的药物。同时，酪氨酸也是一系列工业相关的化合物的前体。酪氨酸通过单个酶的反应就可以转化为黑色素(melanin)，黑色素的物理化学性质使其能够作为紫外线吸收剂，阳离子交换器，药物载体以及非晶半导体。除此之外，酪氨酸还能转化为对羟基肉桂酸(p-hydroxycinnamic acid)和对羟基苯乙烯(p-hydroxystyrene)，这两种物质都是一系列新奇的复合体，涂层，粘合剂，药物分子，化妆品的重要组成成分。

目前酪氨酸的制备方法主要有化学法生产、生物酶催化以及生物发酵。在微生物发酵生产大宗化学品兴起之前，传统的氨基酸的生产主要是酸碱水解来降解一些富含蛋白类的物质，例如酪蛋白，小麦和玉米麸质等。对于酪氨酸的生产，一般是通过水解小麦和玉米麸质，酪氨酸和亮氨酸以及小部分胱氨酸的粗提物被分离出来。但是由于这三种氨基酸在水中，酸溶液和碱溶液中都有着相似的溶解度性质，因此，将这三种氨基酸分离开是比较困难的。同时，化学过程繁杂，产物的转化率较低，存在成本高、环境污染严重等问题。所以开发新的合成方法和思路是今后研究的重点和方向。

生物酶催化法主要是使用酪氨酸酚解酶(Tyrosine phenol lyase，TPL)(EC4.1.99.2)，该酶是需要磷酸吡哆醛的酶。由于其能够转化苯酚，丙酮酸，氨等底物合成酪氨酸，引起了较大的关注。酶催化体系必须提供过量的底物来促进反应的进行。但丙酮酸浓度过高会对酪氨酸酚解酶的酶活有抑制作用，因此在生产过程中必须添加多种底物来维持较低的丙酮酸浓度。除此之外，由于苯酚会破坏细胞壁，使蛋白变性。为了防止酶催化剂被抑制和破坏，苯酚也要保持在一个最低浓度。近些年来，为了改善酶催化效率，也对酪氨酸酚解酶进行了新的研究。例如使用固定化酶和细胞进行催化，开发底物谱更为广泛的新酶等。但生物酶法由于需要相对昂贵的原料，反应条件及工艺较为复杂，生产成本还是偏高，难以适应工业化生产应用。