[发明专利]一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法

权利要求书

1.一种应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)合成用于构建扩增子文库的引物组合；

(2)合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物；

(3)对提取后的样本DNA进行磁珠纯化；

(4)目标区域多重PCR扩增；

(5)PCR添加测序接头序列；

(6)链霉亲和素-生物素捕获目的文库。

2.根据权利要求1所述应用于肿瘤驱动基因检测的文库构建及定量方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)目标区域多重PCR，合成用于构建扩增子文库的引物组合

根据目标区域设计扩增子的上游特异性引物，上游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第一序列和根据目标区域扩增子设计的特异性上游引物序列；根据目标区域设计扩增子的下游特异性引物，下游引物包含按照5’到3’方向的依次排列的通用第二序列和根据目标区域扩增子设计的特异性下游引物序列；

(2)合成用于构建最终待上机文库的Torrent接头引物

根据Ion Proton测序平台P端接头序列设计上游通用引物序列；根据Ion Proton测序平台A端接头序列设计下游通用引物序列；上游引物5’端进行生物素标记修饰，用于后续的基于生物素-亲和素体系的文库定量；

(3)对提取后的DNA进行磁珠纯化

采用1.8倍的AMPure XP磁珠对提取后的样本DNA溶液进行纯化，有效去除小于100bp的DNA片段，提高模板的有效浓度；

(4)目标区域多重PCR扩增

1)配制用于目标区域扩增的PCR反应体系，将步骤(1)所述的含有第一、第二通用序列的目标区域特异性上下游引物按照相同的摩尔浓度进行混合，最终使得每一条引物的终浓度为200nM，以作为目标区域扩增的PCR反应体系中的引物组合；

第一步PCR反应体系包含以下组分：

PCR预混液10ul纯化后的DNA样品20ng目标区域扩增PCR引物组合4ul，200nM无酶水补齐至20ul

所述PCR预混液为Platinum SuperFi Master Mix，Thermo Fisher，cat#12358010 PCR反应程序为：

2)1.0倍AMPure XP磁珠纯化PCR产物，纯化掉引物二聚体以及在上一步没有完全反应的多余引物组合；

(5)PCR添加测序接头序列

进行PCR添加测序接头反应，对目标区域扩增多重PCR反应完成后的目标区域进行富集，同时引入Ion Proton测序平台的测序接头序列；

PCR添加测序接头反应包含以下组分：

PCR预混液25ul纯化后的DNA样品23ul1uMPCR上游引物1ul1uMPCR下游引物1ul

所述PCR预混液为KAPA HiFi Master Mix，KAPA，cat#kk2602 PCR反应程序为：

(6)链霉亲和素-生物素捕获目的文库

采用链霉亲和素磁珠DynabeadsMyone Streptavidin T1，Thermo，cat#65601对含有生物素标记的PCR产物进行捕获，最后采用1N的NaOH进行洗脱，将目标文库与磁珠分离，即得到均一化之后的文库。