[发明专利]多糖裂解单加氧酶LPMO 9D编码基因及酶与制备和应用

说明书

本发明公开了一种来源于嗜热毁丝霉菌的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的编码基因及其酶的制备方法与应用。本发明所涉及的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D来源于嗜热毁丝霉菌(Thermoth elomyces thermophila ATCC 42464)。本发明还提供了一种制备该新型多糖裂解单加氧酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将该新多糖裂解单加氧酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源表达该酶的毕赤酵母重组菌株，用该菌株异源表达制备的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D可以降解PASC(用磷酸处理过的微晶纤维素)生成纤维寡糖和纤维寡糖酸。本发明提供的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D可广泛应用于化工、农业、饲料添加和医药等领域，具有较大的生产潜力和经济价值。

技术领域

本发明涉及一种多糖裂解单加氧酶的基因序列及其酶的制备方法和应用。本发明还提供了该多糖裂解单加氧酶的重组质粒和重组基因工程菌株。本发明的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D可广泛应用于农业、食品、饲料添加及医药等领域。

背景技术

随着经济的高速发展和人口的迅速增长，传统的化石能源如煤、石油等不可再生资源已经不能满足当今世界的经济发展需求。除太阳能和风能等洁净能源外，木质纤维素作为世界上最丰富的可再生资源，以其为原料开发和生产生物质燃料与化学品受到了各国的广泛关注。合理地利用这类资源将会对能源危机的缓解具有重大意义。目前工业上纤维素的转化需经过预处理和糖化两个流程，全程主要采用化学法和酶法联合降解纤维素，糖化过程中酶法的应用主要是通过由内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-1,4-D-葡萄糖苷酶组成的糖苷水解酶酶系降解纤维素，它们对于底物结晶区的降解效率较低，高温下活力易丧失，且成本较高，这使得传统的纤维素酶系难以满足工业应用的需求，限制了纤维素等生物质的高效利用。

多糖裂解单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenases,LPMO)是一类通过氧化还原作用断裂生物质多糖(纤维素、几丁质和淀粉等)的氧化酶，它能破坏难溶性多糖物质的结晶区产生较为疏松开放的底物结构。它的出现提高了难溶性多糖的降解效率，使得生物质的高效转化成为可能。多糖裂解单加氧酶的来源非常丰富，目前已从细菌(如Streptomyces coelicolor A3(2))、真菌(如Neurospora crassa OR74A)和病毒(如Anomala cuprea entomopoxvirus CV6M)中发现该类酶的。目前已经报道的LPMO有49个，其中AA9家族有26个，AA10家族有19个，AA11家族有1个，AA3家族有3个；本发明中的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D来源于嗜热毁丝霉菌，属于AA9家族，具有区别于其他家族多糖裂解单加氧酶的耐高温性质，它在纤维素糖化过程的应用能提高反应温度缩短糖化时间和减小反应器受污染几率，且该酶的最适作用条件为酸性环境，较其他LPMO适用于工业上酸预处理后的纤维素处理，该酶是一个新型的LPMO，它的克隆表达为后续纤维素的高效降解奠定基础。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于嗜热毁丝霉菌(Thermothelomycesthermophila ATCC 42464)的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的方法。

本发明的第三个目的是提供含有上述的多糖裂解单加氧酶lpmo 9D基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的另一个目的是提供新型多糖裂解单加氧酶LPMO 9D在纤维素降解中的应用。

本发明所提供的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D，来源于嗜热毁丝霉菌(Thermothelomyces thermophila ATCC 42464)，其氨基酸序列具有如下特征中的至少一个：

1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-303或20-303位氨基酸残基序列，其中1-19位为信号肽，20-303位为有活性的多糖裂解单加氧酶LPMO 9D的氨基酸序列。