[发明专利]一种斑马鱼DNA甲基化酶亚型生物质谱相对定量方法

说明书

本发明涉及一种斑马鱼DNA甲基化酶亚型质谱相对定量方法，涉及斑马鱼的DNA甲基化酶的7种亚型，包括DNMT1、DNMT3、DNMT4、DNMT5、DNMT6、DNMT7以及DNMT8，包括以下步骤如下：步骤1、蛋白样品预处理；步骤2、标准曲线制备；步骤3、蛋白样品中DNMT亚型含量测定。本发明相方法对每种DNMT亚型利用多种特异性肽段同时进行分析和定量，消除样品处理及测定所带来的误差，提高方法准确度。

技术领域

本发明涉及蛋白质组学技术领域，尤其是涉及一种同时测定斑马鱼的7种DNMT的质谱绝对定量方法。

背景技术

DNA甲基化是基因表达调控中一种常见而又重要的机制，是表观遗传学的重要事件，在细胞分化与增殖、生物体老化、肿瘤发生等多种重要生命活动中具有重要作用。斑马鱼作为一种经典的科研模式生物，其具有与人体相似的DNA甲基化酶系统，较为准确地反映出DNA甲基化生命现象的本质和机制。而DNA甲基化酶是甲基基团从供体向DNA转移的重要催化酶，准确定量DNA甲基化酶水平及为表观遗传学研究提供重要基础。

现有蛋白定量分析方法主要有基因探针法，Western Blot法，ELISA法以及mRNA检测法等。然而上述方法中Western Blot法和ELISA中专一性的抗体不易制备；由于mRNA翻译为蛋白质受到翻译调控影响，基因探针法和mRNA法均是从基因表达定量层面间接反映蛋白质水平的方法均无法真实定量蛋白质含量。以上方法无法满足表观遗传学研究的要求。近年来多反应监测技术（MRM）逐渐发展起来，这是一种基于LC/MS/MS的方法，根据已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术，具有特异性强，高通量，高灵敏度等优点。目前，关于斑马鱼DNA甲基化酶亚型的质谱定量方法仍未出现。因此，建立一种DNMT亚型的定量方法是十分必要的。

发明内容

本发明设计了一种斑马鱼DNA甲基化酶亚型生物质谱相对定量方法，其解决的技术问题是现有技术中的斑马鱼DNA甲基化酶亚型的质谱定量方法仍未出现，也就无法可以同时测定斑马鱼的7种DNMT亚型质谱相对定量方法，其中涉及的7种DNMT分别是DNMT1、DNMT3、DNMT4、DNMT5、DNMT6、DNMT7、DNMT8。

为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：

一种斑马鱼DNA甲基化酶亚型质谱相对定量方法，涉及斑马鱼的DNA甲基化酶的7种亚型，包括DNMT1、DNMT3、DNMT4、DNMT5、DNMT6、DNMT7以及DNMT8，包括以下步骤如下：步骤1、蛋白样品预处理；步骤2、标准曲线制备；步骤3、蛋白样品中DNMT亚型含量测定。

进一步，步骤11、将1-5 mg蛋白质沉淀溶于100 mmol/L碳酸氢铵和体积浓度比为5%乙腈水溶液中；

步骤12、用Tris缓冲液将溶液调整为pH 8.0，取少于1μL的重悬蛋白液滴于0-14的pH试纸上进行pH值的检测；

步骤13、取100～200μL蛋白质样品，样品含蛋白质1 mg，加入20μL浓度为25μmol/L的内参肽溶液，所用内参肽的氨基酸序列VPTPNVSVVDLTVR；

步骤14、加入1/10体积的50 mmol/L二硫苏糖醇DTT，60 ℃孵育 20-40 min；

步骤15、加入1/10体积的100 mmol/L碘乙酰胺溶液，避光，30 ℃孵育30 min；

步骤16、加入修饰过的40-80μg 测序级胰蛋白酶，37 ℃孵育9～12小时；

步骤17、用5～20μL 甲酸将反应终止，得到蛋白样品反应液；