[发明专利]一种提高重组人凝血因子VIII高效表达的方法在审
| 申请号： | 201711346319.X | 申请日： | 2017-12-15 |
| 公开（公告）号： | CN109929029A | 公开（公告）日： | 2019-06-25 |
| 发明（设计）人： | 肖海鹏;陈英;李利佳;胡育龙;龚庆伟;陈小锋;李文佳 | 申请（专利权）人： | 广东东阳光药业有限公司 |
| 主分类号： | C07K14/755 | 分类号： | C07K14/755;C12N15/85;C12N5/10 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 523808 广东省*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 重组人凝血因子 高效表达 表达量 构建 人凝血因子VIII 哺乳动物细胞 基因工程技术 重组表达质粒 血清培养基 工程细胞 基因序列 基因重组 阳性细胞 生物制品 细胞株 研发 筛选 研究 治疗 应用 开发 生产 | ||
1.一种提高重组人凝血因子VIII高效表达的方法，包括以下步骤：
(1)重组基因的构建，所述重组基因包含信号肽基因和rhFVIII基因；
(2)将上述重组基因片段插入质粒中，得到重组质粒；
(3)将上述重组质粒进行PvuI线性化，电转至哺乳动物细胞中，经鉴定与活性测定，筛选阳性细胞株；
(4)将上述筛选得阳性细胞株接种至细胞培养基中，培养4-5天，向细胞培养基中添加外源胎牛血清，收集培养液进行活性测定；其特征在于，所述胎牛血清的加入量为2-6％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中rhFVIII的核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中信号肽为优化后的天青杀素前原蛋白(Azu)，核苷酸序列为SEQ ID NO：4，得到的重组基因为Azu-rhFVIII，核苷酸序列为SEQ ID NO：6。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组基因Azu-rhFVIII的氨基酸序列为SEQ ID NO：7。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的质粒为pXC17.4，得到的重组表达质粒为pXC17.4-Azu-rhFVIII。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵细胞CHOK1SV-KO。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中细胞培养基为CD CHO AGT培养基。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中胎牛血清的加入量为3-5％。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中胎牛血清的加入量为3％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中阳性细胞株的筛选方法为：将电转细胞接种至无血清培养基中，在35-37℃培养1天后，离心弃上清，往细胞沉淀加入预热好的培养基(50μmol/L MSX CD CHO AGT培养基)重悬，将重悬液转入锥形瓶继续培养，培养至10天后，取样通过PCR及活性鉴定，筛选得阳性细胞株CHOK1SV-KO/pXC17.4-Azu-rhFVIII。
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