[发明专利]甲状腺激素受体(TSHR)mRNA核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）

说明书

本发明为一种甲状腺激素受体(TSHR)mRNA核酸定量检测试剂盒（PCR‑荧光探针法）。通过RT‑PCR的方法，将样品中的mRNA逆转录得到相应的cDNA，再利用本试剂盒特定的引物和探针，结合实时荧光定量PCR检测技术，可以准确检测样本中甲状腺激素受体(TSHR)mRNA的表达量。此种检测方法可以对肿瘤患者的外周血及肿瘤组织﹑骨髓等样本中的甲状腺激素受体(TSHR)mRNA的表达进行定量分析，临床上可以用以辅助诊断和评价预后的治疗效果。本发明通过分子学上的医学检测手段来指导临床治疗，具有一定的临床价值。

技术领域：

本发明属于生物技术人领域，为通过逆转录(RT)mRNA样品得到cDNA，现结合实时荧光定量PCR技术，可以精确定量检测标本中人甲状腺激素受体(TSHR) mRNA表达量的试剂盒。

背景技术：

现今，甲状腺癌依然是人类健康的重大威胁。目前,手术切除、化疗、放疗及内分泌治疗依然是甲状腺癌治疗的主要方法。在上述技术已经达到相当成熟和普及的同时，高复发和转移率也依然是甲状腺癌患者面临的主要问题，这些问题的出现对患者的有效生存期起着重要的影响，严重危害着肿瘤患者术后的生活质量。那么如何在患者术后检测其肿瘤的复发和转移成了众多学者的研究课题。 2000年以后，很多学者都在研究将分子生物学领域应用到人类健康课题上来，至今已经十几年，由此而发展的体外检测技术也在不断成熟和完善中。其中 TaqMan荧光定量PCR就是其中的一种体外诊断技术。

由于TaqMan荧光定量PCR具有重复性好，结果准确可靠的特点，所以在医学检测方面，一些常规检测方法所不能解决的问题可以以此解决。一般来说细胞形态学检查可直接观测到肿瘤细胞，但仅限于组织的病理检测。由于肿瘤脱落至血循环中的数目微小，这种检查的敏感性和特异性均较差，阳性率仅为1％。后期的免疫组织化学方法提高了检出率，但该技术生产复杂，且需要特异性的抗体，而且假阳性率也高。TaqMan荧光定量PCR与这些技术相比，有着明显的优点，由于有些肿瘤可转录特异性mRNA，但无相应蛋白合成，故荧光定量PCR 应用范围较蛋白广泛；另外只要知道待测基因序列，即可设计合成引物探针进行逆转录及扩增，操作方便；同时该方法具有较高的灵敏度及可重复性，保证了医学检测结果的准确性。

以甲状腺激素受体(TSHR)mRNA检测为例，甲状腺激素受体(TSHR)mRNA是甲状腺癌的特异性的生物标志物，是原发性甲状腺癌特异性较高的肿瘤相关抗原，在健康人外周血细胞中检测不到甲状腺激素受体(TSHR)mRNA，而在复发和转移的甲状腺癌患者中，如果癌细胞脱落于血液中便可以检测到。与此同时，TaqMan荧光定量PCR技术具有很好的灵敏性和特异性，有针对性的对甲状腺癌患者外周血及肿瘤组织﹑骨髓等样本中的甲状腺激素受体(TSHR)mRNA的表达进行检测，便可以对甲状腺癌细胞血行播散等诊断提供重要的依据。所以该技术的应用，将会对早期寻找甲状腺癌患者血循环中的肿瘤细胞，发现甲状腺外微小转移对于指导临床治疗、改善患者预后产生极为重要的作用。

发明内容：

本发明为一种甲状腺激素受体(TSHR)mRNA核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，含有4种组分，分别为：一步法RT-PCR反应液(360μL/管)，阳性对照品(50μL/管)、阴性对照品(50μL/管)、2×10⁶copies/μl标准品(20μL/ 管)主要成份组成。

一步法RT-PCR反应液中含有DEPC处理的水、逆转录酶、Taq酶、dNTPs、 RT-PCR缓冲液、寡聚(dT)_15-18、MgCL₂(3mM)、检测用上游引物(0.2μM)、检测用下游引物(0.2μM)、荧光探针(0.3μM)，其中：

检测用上游引物序列为：5’—CGGAGGATGGAGAAATAG—3’

检测用下游引物序列为：5’—CGTTGAATATCCTTGCAG—3’