[发明专利]一种检测氨肽酶N活性的比色方法

说明书

本发明公开了一种检测氨肽酶N活性的比色方法，通过葫芦[8]脲识别结合多肽探针，以金纳米颗粒作为比色信号报告单元进行比色分析，进行氨肽酶N的活性检测。本发明所述的检测氨肽酶N活性的比色方法，方法简单、合理，基于多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体，结合氨肽酶N对于多肽探针N‑末端中性氨基酸的识别切割活性，成功构建了一种新型的检测氨肽酶N活性的比色分析方法。实验结果表明，本发明构建的检测方法具有良好的灵敏度和可重复性，检测限可以达到0.096µg/mL。同时，还具有无需大型昂贵仪器和额外标记等优点，因而在临床分析检测中具有很高的应用前景。

技术领域

本发明属于生物电化学传感器技术领域，具体地，涉及一种检测氨肽酶N活性的比色方法。

背景技术

氨肽酶N（AminopeptidaseN），又称CD13，隶属于金属蛋白酶M1家族，其活性具有锌离子依赖性。氨肽酶N广泛存在于多种组织、器官和细胞中，它是细胞膜上的II型整合膜蛋白，其通过分子内一段靠近N末端的螺旋跨膜结构域固定于细胞膜上。氨肽酶N拥有广泛的底物选择性，它能够从蛋白质、多肽或酰胺上水解释放N-末端的中性或碱性氨基酸，如丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸等。在生物体内，氨肽酶N能够作用于脑啡肽、血管紧张肽、神经激肽和细胞因子等生物活性分子，从而参与免疫调节、细胞生长和血压调节等诸多重要的生理代谢过程。

癌症是世界范围内严重威胁人类健康的恶性疾病之一。肿瘤细胞的侵袭和转移是癌症的基本生物学特征，也是导致患者复发或死亡的主要原因。尽管肿瘤细胞的转移是一个涉及到细胞粘连、趋化、血管增生等一系列生理事件的复杂过程，但肿瘤细胞和其周围的蛋白水解酶的相互作用对肿瘤的恶化起到了很关键的作用。最近有研究发现，氨肽酶N和肿瘤的发生发展密切相关。例如，氨肽酶N可以促进细胞外基质的降解，这一方面可以释放某些加速肿瘤细胞增殖的生长因子，提高肿瘤细胞的生物利用度；另一方面可以为肿瘤微血管的形成提供空间，从而为肿瘤细胞的侵袭转移奠定有利基础。

由于氨肽酶N与肿瘤发生发展的这种密切关系，其在肿瘤组织或细胞中的表达和活性也得到了深入的研究。1990年，Mechtersheimer和Möller最先采用免疫组化的方法对氨肽酶N在间叶性肿瘤组织中的表达程度进行了分级。1999年，Martínez和他的同事用荧光的方法对乳腺癌组织中的氨肽酶N活性作了检测。通过对比肿瘤细胞和周围未感染的组织细胞，他们发现氨肽酶N的活性在乳腺癌肿瘤细胞中是明显提升的。后续一系列的研究证明，氨肽酶N的活性在卵巢癌、肝癌、肺癌等癌症组织中也存在明显的上升。更为重要的是，在乳腺癌和甲状腺癌患者血清中，氨肽酶N的活性也被发现存在异常上调。因此，氨肽酶N的活性可以作为多种癌症诊断的重要指标。在此背景下，发展高效可靠的生物传感方法，实现对氨肽酶N活性的灵敏检测，有望在癌症诊断过程中发挥重要的作用。

随着超分子化学的快速发展，一系列人工合成的大环主体分子在构建分子器件、药物传输系统和生物传感方法中的应用价值引起研究者越来越多的兴趣。其中，由八个甘脲分子缩合而成的葫芦[8]脲（cucurbit[8]uril，CB[8]）因其能够同时与两分子客体结合形成三元超分子体系的独特性质而备受关注。

发明内容

发明目的：借助CB[8]同时识别结合两分子多肽探针N-末端苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FGGG）序列的特性，并利用金纳米颗粒作为比色信号报告单元，我们提供了一种检测氨肽酶N活性的比色分析方法。并且该方法能够实现最低0.096μg/mL氨肽酶N的活性检测，具有良好的应用前景。