[发明专利]一种亲和膜色谱法纯化玻璃酸酶的方法

权利要求书

1.一种亲和膜色谱法纯化玻璃酸酶的方法，其特征在于，本发明提供了一种亲和膜色谱法提取玻璃酸酶的方法，采用尼龙膜为基质，键合壳聚糖的方法对尼龙膜进行改性，使膜的非特异性吸附大大降低，得到一种新的染料亲和膜，对玻璃酸酶有较好的吸附性，纯化倍数很高。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（一）亲和膜的制备

尼龙膜的活化：

尼龙膜先在40℃，1mol/L的HCL中水解4h，然后用甲醛进行活化.然后将10张水解的尼龙膜浸入20mL甲醛溶液（>36.5%），加入0.2ml 85%的磷酸，于60℃反应7h，40-50℃热水水洗5-8次；

尼龙膜的壳聚糖改性处理：

将上述甲醛活化的尼龙膜，浸入10ml质量分数为1.5%的壳聚糖溶液（以体积分数为1%醋酸溶解），室温反应1h，然后转入80℃烘箱，1h后取出，分别以1%醋酸和去离子水洗去未反应的壳聚糖；

染料亲和膜的制备：

20张上述改性的尼龙膜浸入200ml的10mg/ml的Cibacron Blue F3GA的水溶液，在60℃下密封搅拌30min，然后加入50ml质量分数为20%的NaCl溶液，反应30min后升温到80℃，加入20ml质量分数为25%的Na₂CO₃进行固色，继续反应4h后冷却，依次用热水、甲醇、2mol/LNaCl、6mol/L尿素、去离子水充分洗涤，直到洗涤液为无色，保存于pH8.0的0.05mol/lTris-HCl缓冲液中；

（二）亲和膜对玻璃酸酶的静态吸附

采用静态吸附法，称取0.1g干燥的膜放入玻璃酸酶溶液中，调pH，震荡吸附一定时间；

（三）色谱过程

将20张亲和膜叠成膜堆，装入膜桥，首先以0.05mol/L，pH8.0的Tris-Hcl缓冲液配成溶液65ml（10.0mg/mL），以2.0ml/min的流速上样，然后以30ml平衡缓冲液冲洗膜堆，以除去膜上未被吸附的蛋白，直至流出液的吸光度接近0.最后用洗脱液洗脱被吸附的玻璃酸酶。

3.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤（二）中调pH 3.2-4.0。

4.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤（二）中震荡吸附的温度为室温。

5.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤（二）中震荡吸附的时间为2-4小时。

6.权利要求书2所述的方法，其特征在于，步骤（三）中所用洗脱液为pH6.0，0.05mol/L的含1.0mol/L NaSCN的Tris-HCl缓冲液。