[发明专利]一种HIP/PAP蛋白的制备方法

说明书

本发明公开了一种HIP/PAP蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)设计目的蛋白的基因序列；(2)合成用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段FHIP/PAP；(3)构建表达载体；(4)转染；(5)目的蛋白的纯化；(6)目的蛋白的活性测定。本方法为可溶性表达，克服了常规的大肠杆菌不能可溶性表达HIP/PAP，只能包涵体表达的局限；本发明制备HIP/PAP蛋白的方法具有操作简单，不需要复性，并且活性显著高于常规包涵体表达等优点，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种HIP/PAP蛋白的制备方法。

背景技术

人HIP/PAP蛋白(Hepatocarcinoma-Intestine-Pancreas/Pancreatitis-Associated Protein)，又称再生蛋白3α(Regenerating islet-derived protein III-alpha)，是由胰腺分泌的165个氨基酸组成的蛋白质。

1984年，KEIM等人首次在大鼠急性胰腺炎模型胰液中发现了一种新的分泌性蛋白质，由于这种蛋白质与急性胰腺炎的发生发展密切相关，故将其称为胰腺炎相关蛋白(pancreatitis-associated protein，PAP)。LASSERE等人通过对人肝细胞癌cDNA文库的研究，成功克隆出肝肿瘤-肠道-胰腺基因(hepatocarcinoma-intestine-pancreas，HIP)，且证实HIP基因和PAP基因为同源基因，称之为HIP/PAP。HIP/PAP能防御肝细胞免于肿瘤坏死因子介导的程序性死亡，同时也是一种促有丝分裂剂，能促进肝细胞有丝分裂，从而促进肝细胞再生。同时，HIP/PAP参与细胞免疫、细胞增殖分化、抗细胞凋亡、炎症、抗菌等多种生理或病理过程，有希望用于急性肝衰竭、溃疡性结肠炎等多种疾病的治疗。HIP/PAP蛋白还参与多种生理和病理代谢，目前已发现其在炎症、糖尿病、肿瘤等疾病组织中均有表达。

目前重组表达HIP/PAP蛋白的主要方式为大肠杆菌包涵体表达，刘彤等人描述了在大肠杆菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中以包涵体形式表达HIP/PAP蛋白，然后通过复性、阳离子交换柱和凝胶过滤柱纯化重组蛋白(重组抗菌蛋白Reg3γ的表达、纯化及鉴定.中国实验诊断学，2016年，20(4)：536-539)。US20110229435A1记载了可以用大肠杆菌作为宿主细胞表达HIP/PAP蛋白，HIP/PAP蛋白表达为包涵体形式，并通过复性和阳离子交换柱纯化重组蛋白。之所以采用无活性的包涵体表达形式，是由于HIP/PAP蛋白本身具有抗菌活性，若采用可溶形式表达会对宿主大肠杆菌产生毒性。但包涵体表达具有操作复杂、复性效率低、蛋白活性差等缺点。CN1835764B公开了在转基因小鼠的乳汁中产生并纯化HIP/PAP蛋白，但在转基因动物中表达具有操作繁琐、产量低、成本高等缺点。迄今为止，本领域尚没有关于用哺乳动物细胞为宿主重组表达HIP/PAP蛋白的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种HIP/PAP蛋白的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种HIP/PAP蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计目的蛋白的基因序列：根据HIP/PAP蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和哺乳动物的密码子偏好，通过密码子优化得到编码HIP/PAP蛋白的核苷酸序列，并据此设计用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段F_HIP/PAP(SEQ ID NO：2)；

(2)合成用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段F_HIP/PAP；

(3)构建表达载体：将合成的用于表达HIP/PAP蛋白的基因片段FHIP/PAP利用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，插入同样双酶切的pTT5质粒，构建表达载体pTT5-HIP/PAP；