[发明专利]一种脂肪氧合酶制备与纯化方法

说明书

本发明提供了一种脂肪氧合酶的制备与纯化方法，该制备方法包括以下步骤：（1）将大豆粉碎溶解，通过盐析法得到粗酶提取物；（2）阴离子交换层析：采用阴离子交换层析，利用分段洗脱的方法对粗提物进行初步纯化；（3）亲和柱层析：采用亲和柱层析进一步分离与纯化得到较纯的脂肪氧合酶。本方法的优点是：方法工艺分离效果好，得到的酶活性高，回收率高，生产成本低，可工业化生产。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说是一种脂肪氧合酶制备与纯化方法。

背景技术

脂肪氧合酶又称脂肪氧化酶, 脂氧酶, 属于氧化还原酶, 是一类含非血红素铁的蛋白质, 能专一催化具有顺, 顺4-烯结构的多不饱和脂肪酸, 通过分子内加氧, 形成具有共轭双键的氢过氧化衍生物, 可导致果蔬加工制品产生不良的风味, 油脂和含油食品在贮藏和加工过程中色、香、味发生劣变等。但脂肪氧合酶作为绿色食品添加剂可改善小麦粉品质, 在食品、化工等领域都有应用, 其研究对现代食品、工业、发酵等行业的发展具有重要意义。在医药行业中，脂肪氧合酶能催化生成各种类花生酸物质，在癌症预防和治疗中发挥重要作用，有望成为新的抗癌药物作用靶点。

目前国内外对脂肪氧合酶的提取与纯化方法的研究也有很多，初步提取脂肪氧合酶的方法主要有水浸提法、盐析法及共沉淀法3种，进一步分离提纯的方法主要有有机溶剂沉淀法、聚合物沉淀法、双相分离法、透析、离子交换柱层析、凝胶过滤以及各种电泳技术分离和鉴定，还包括基因重组技术获得重组脂肪氧合酶，由于植物中含有的色素、杂蛋白和糖类物质等比较丰富，给后续的纯化过程带来麻烦，因此需要一种较为简单有效的方法来进行纯化，已达到高回收率和更高的酶活力。

发明内容

本发明提供了一种脂肪氧合酶的制备与纯化方法，该制备方法包括以下步骤：

（1）粗提取：将大豆利用机械粉碎至120目,然后按料液比1:3-1:10加入0.01-0.05mol/l磷酸盐缓冲液（pH=7.0）混合搅拌，4500r/min离心20min，取上清液加入固体硫酸铵使其中硫酸铵浓度为30%-50%并加入氨水调节pH 6.0-8.0，摇匀，静置2-5h, 4500r/min离心10-40min，弃去上清，将沉淀物用蒸馏水溶解后用截留分子量为10-15KDa的超滤膜进行超滤得粗酶提取液。

（2）初步纯化：用0.01-0.05mol/l磷酸盐缓冲液，pH 7.0-8.5平衡阴离子交换层析柱（DEAE-sephadex型）1-3h，流速为1-8mL/min，将粗提液缓慢上样，分别用含0.1mol/LNaCl、0.5mol/L NaCl的0.05-0.2mol/l磷酸盐缓冲液，pH 7.0-8.5以1-8mL/min的流速分段洗脱，收集并合并洗脱液。

（3）再纯化：用2个柱体积的磷酸盐缓冲液对CH-Sepharose 4B型亲和层析柱进行平衡，将步骤（2）纯化后合并的样品上样到色谱柱上，流速控制在1-8mL/min并用0.1-0.5mol/l Tris缓冲液，pH 4.0-6.5以5-10mL/min的流速进行洗脱，，用紫外分光光度计进行检测，洗脱至OD值≤0.2为止，停止收集流出液。

（4）冷冻真空干燥：将上述产品进行冷冻真空干燥，得到干燥后的酶产品。

本发明的目的与积极效果是：本方法通过采用分步纯化，分段洗脱，加上几种常见的分离手段，经过几步纯化步骤就可以达到较好的分离纯化目的，在纯化过程中，反应条件温和，试剂毒性低，对人体和环境基本无危害，成本低，适合工业化生产。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1