[发明专利]一种全人源的抗VEGF单链抗体及其应用

说明书

本发明公开了一种全人源的抗VEGF单链抗体，所述单链抗体具有独特的CDR区，对抗原具有高度特异性的识别能力。所述单链抗体又具有优异的肿瘤结合效果，其对不同类型的胰腺癌细胞系均有特异性结合。本发明还公开了偶联了指示剂的所述抗体在制备体外肿瘤诊断试剂和体内生物成像剂中的应用。当所述成像剂应用在肿瘤动物模型上，标记了近红外荧光的该单链抗体可以清楚地显示出小鼠肿瘤的大小和位置，具有极高的体内成像能力。

技术领域

本发明涉及一种抗体，更为具体地，本发明涉及一种单链抗体。

背景技术

肿瘤是威胁人类生存最大的疾病。世界卫生组织研究显示，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。

肿瘤的临床诊断技术也在逐渐提高。从最初的肿瘤标记物的检测、超声、透视等手段，发展到现在更多的肿瘤相关因子的蛋白水平和分子水平的检测、CT、核磁、PET、SPET，以及肿瘤微创的活检等等技术都已在临床上广泛应用。

肿瘤的诊断分为体外和体内诊断。在体外，肿瘤组织的免疫组织化学染色是确诊肿瘤的一个重要指标。体内诊断，一般是利用一些显像剂再辅助一些仪器进行肿瘤成像。肿瘤体内成像不仅能够早期诊断肿瘤，而且能够实时监测抗肿瘤治疗的效果以及肿瘤的进展情况。因为它是无创检查，给病人带来的痛苦小，已经成为临床确诊和治疗肿瘤的必不可少的诊断手段。目前医院常用的肿瘤体内显像使用的是放射性核素显像，以及核磁。

近年来，光学成像以其非侵袭性、实时、分辨率高等优势广泛应用于肿瘤研究领域，可对肿瘤进行早期诊断，反映肿瘤解剖学结构及代谢情况。近红外荧光成像是目前光学分子成像领域研究的热点，其光谱范围为700-1000nm，在此波段范围内被监测的生物体与组织的自发荧光干扰较小，穿透组织距离可高达数厘米，提高了成像的准确度和灵敏度。

用来确诊肿瘤的靶点通常都是细胞表面蛋白。而我们发现血管内皮生长因子(VEGF)也可以作为一个肿瘤诊断的靶标，VEGF是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。抗血管内皮生长因子的抗体可以使用在组织切片染色和confocal染色，也同样可以使用在体内作为肿瘤成像剂。

随着肿瘤靶点不断增多，利用特异性针对肿瘤靶抗原的抗体作为指示剂的研究也在逐渐深入。但是传统的全分子抗体分子量较大，并不能很快分布到全身，也不能很好地结合一些被遮蔽的靶位，所以抗体作为指示剂的可行性大打折扣。但是基因工程技术创造出了仅有抗原结合功能的分子量小的抗体片段，使得这一设想得以实现。但是这种小分子量抗体片段在应用中也出现了诸多问题，例如稳定性差，特异性不高，存在异源性免疫反应、以及抗体与指示剂的偶联适应度不高等问题而限制了这一诊断手段的进一步应用。

发明内容

基于现有技术存在的问题，本发明的目的是研发出一种具有特异性识别能力的抗血管内皮生长因子(VEGF)的单链抗体，进而提供一种指示剂与该抗体偶联的生物偶联物，并提供该偶联物在制备体外诊断试剂及体内成像剂中的应用。

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗血管内皮生长因子的单链抗体，所述抗体的轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示。

在一个优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。

在一个更为优选的技术方案中，所述抗体的轻链可变区和重链可变区通过连接多肽相连。