[发明专利]一种快速高效获取木棉组培苗的方法

权利要求书

1.一种快速高效获取木棉组培苗的方法，其特征在于：具体技术方案如下：

a.获取能够快速形成愈伤组织的外植体，是将木棉种子用10％的过氧化氢表面消毒10min，埋入装有高压蒸汽灭菌2h的河沙的磁盘中，置于22～26℃，湿度65～75％，光照3000Lux，光照时间12h培养箱中培养育苗，待木棉种子长成5～8cm高的幼苗，去除幼苗的根和叶获得木棉苗的幼茎作为外植体；

b.无菌处理，是将去除根和叶的木棉幼苗茎段放入无菌蒸馏水中浸泡20～35min，然后用75％的乙醇消毒30s，再用0.1％HgCl₂消毒5～8min，用无菌蒸馏水冲洗5遍去除木棉苗表面的消毒液，再用无菌滤纸吸干外植体上多余的水分；

c.木棉愈伤组织的诱导培养，是将木棉幼苗茎段用解剖刀切成长0.3～0.6cm的小段，接入愈伤组织诱导培养基，每个培养皿3～8个，置于22～26℃，湿度65～75％的培养箱中暗培养10～21d脱分化成愈伤组织，愈伤组织诱导培养基的具体参数为：MS+2mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+5g/L葡萄糖+15g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，灭菌前pH调至5.8～6.0；

d.愈伤组织增殖培养，是将愈伤组织接入愈伤组织增殖培养基，每皿接种3～8个切成直径为0.2～0.5cm的愈伤组织小块，此时温度、湿度、光照条件与愈伤组织诱导培养一致，10～15d后，愈伤组织长至0.7～1.5cm的淡黄色球状体，愈伤组织增殖培养基具体参数是：MS+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA+5g/L葡萄糖+15g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，灭菌前pH调至5.8～6.0；

e.木棉胚性愈伤组织锻炼培养，是将扩繁的愈伤组织块切成直径为0.4～0.7cm的愈伤组织小块，接入胚性愈伤组织锻炼培养基，每皿3～8个培养，置于温度为22～26℃，湿度为50～60％，光照2000Lux，光照时间12h/d的培养箱中继续培养8～14d，获得胚性愈伤组织，胚性愈伤组织锻炼培养基具体参数是：1/4MS+0.1mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+20g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，灭菌前pH调至5.8-6.0；

f.木棉胚性愈伤组织芽分化培养，是将胚性愈伤组织接入诱芽培养基培养，温度为22～26℃，湿度为55～65％，光照3000Lux，光照时间12h/d培养箱中培养，获得芽和愈伤组织，诱芽培养基具体参数为：MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+20g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，灭菌前pH调至5.8～6.0；

g.生根培养，是将芽基部的愈伤组织切下放入新的愈伤组织增殖培养基中进行新一轮的增殖培养和胚性愈伤组织锻炼培养，将芽接入装有诱根培养基的三角瓶中，置于温度为22～26℃，湿度为50～60％，光照3000Lux，光照时间12h/d培养箱中进行生根培养，培养25～33d，主根长1.5～4cm，获得组培苗，周而复始获得大量组培苗，诱根培养基具体参数为：1/2MS+0.2mg/L NAA+15g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，灭菌前pH调至5.8～6.0。

2.根据权利要求1所述的一种快速高效获取木棉组培苗的方法，其特征在于：

a.将木棉种子置于25℃，湿度75％，光照3000Lux，光照时间12h培养箱中培养育苗，待木棉种子长成6cm高的幼苗，去除幼苗的根和叶获得的木棉苗的幼茎作为外植体；

b.将去根和叶片的木棉幼苗茎段放入无菌蒸馏水中浸泡30min，然后用75％的乙醇消毒30s，再用0.1％HgCl₂消毒6min；

c.将木棉幼苗茎段用解剖刀切成长0.5cm的小段，接入愈伤组织诱导培养基，每个培养皿5个，置于24～26℃，湿度70～75％的培养箱中暗培养16d脱分化成愈伤组织；

d.将愈伤组织接入愈伤组织增殖培养基，每皿接种3～5个切成直径为0.3～0.5cm的愈伤组织小块，此时温度、湿度、光照条件与愈伤组织诱导培养一致，12d后，愈伤组织长至0.8～1.2cm的淡黄色球状体；

e.将扩繁的愈伤组织块切成直径为0.5cm的愈伤组织小块，接入胚性愈伤组织锻炼培养基，每皿3～5个培养，置于温度为24～26℃，湿度为55～60％，光照2000Lux，光照时间12h/d的培养箱中继续培养10～12d，获得胚性愈伤组织；

f.将胚性愈伤组织接入诱芽培养基培养，温度为24～26℃，湿度为60～65％，光照3000Lux，光照时间12h/d培养箱中培养，获得丛生芽和愈伤组织；

g.将芽基部的愈伤组织切下放入新的愈伤组织增殖培养基中进行新一轮的增殖培养和胚性愈伤组织锻炼培养，将切下来的芽插入装有诱根培养基的三角瓶中，置于温度为24～26℃，湿度为55～60％，光照3000Lux，光照时间12h/d培养箱中进行生根培养，培养26～30d，主根长2～3cm，获得组培苗。