[发明专利]DNA片段、含有该片段的重组载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了DNA片段，由序列表中的SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成。本发明还公开了含有外源多核苷酸的重组载体，包含原始载体以及MLAA34‑B7H4融合基因。本发明还公开了构建含有外源多核苷酸的重组载体的方法，利用序列表中的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物序列扩增得到含有SEQ ID NO.4所示的碱基序列的MLAA‑34基因，利用序列表中的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物序列扩增得到含有SEQ ID NO.7所示的碱基序列的B7H4基因，以MLAA‑34基因和B7H4基因为模板，利用序列表中的SEQ ID NO.2和序列表中的SEQ ID NO.6所示的引物序列，扩增得到序列表中的SEQ ID NO.1所示的MLAA34‑B7H4融合基因，将MLAA34‑B7H4融合基因构建到原始载体上以得到重组载体。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及DNA片段与含有该片段的重组载体、构建重组载体的方法及其应用。

背景技术

急性白血病是一种常见的血液系统恶性肿瘤，是人类致死性疾病之一。目前，随着白血病联合化疗和放疗技术的发展，急性白血病的预后也在不断改善。然而由于白血病肿瘤细胞的微小残留病变(MRD)不能被彻底清除，疾病复发率及死亡率较高。因此，寻找有效的清除残留的白血病细胞的方法是我们所面临的迫切的课题和任务。

研究发现，核酸疫苗可以进行结构修饰，并且能够插入外源基因，调节并放大免疫反应，可以同时诱导体液免疫和细胞免疫，核酸疫苗能够激发白血病患者特异性免疫应答，清除化疗后残余肿瘤细胞，是有望克服MRD的方法之一。核酸疫苗的免疫效果是决定核酸疫苗抗白血病作用强弱的关键。提高核酸疫苗免疫效果的方式主要有优化抗原表位基因、添加免疫佐剂、加载细胞因子以及改进接种途径等。其中，抗原表位基因是核酸疫苗的关键，优化抗原表位基因可以从根本上改变抗原蛋白的免疫原性，从而提高核酸疫苗的免疫效果。

MLAA-34是Cheng G等通过生物信息学方法筛选出的与白血病发病相关的新的抗原基因，其cDNA全长1671bp，具有完整的ORF框。Zhang等应用RNAi技术研究发现MLAA-34基因是和急性单核细胞白血病发生相关的一个新的抗凋亡分子，在急性单核细胞白血病患者体内表达水平明显增高。MLAA-34基因表达下调能显著抑制U937细胞在体外的增值，同时会诱发这些白血病细胞的凋亡，而MLAA-34的过表达可通过多种机制抑制白血病细胞的凋亡，并与急性白血病的低生存率等不良预后密切相关，因此，MLAA-34可作为急性白血病的新肿瘤标志物及基因免疫治疗的靶基因。

B7-H4是B7家族最新发现的成员，与B7-H1/PD-1、B7h/ICOS、B7-H3和BTLA同属B7家族，在T细胞活化和耐受的免疫调节过程中，B7家族成员介导的T淋巴细胞共刺激信号传导途径起着至关重要的作用。B7-H4是一种负性共刺激分子，特异性地表达在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肾癌等一些肿瘤组织中，在正常组织中几乎检测不到B7-H4的表达，但在活化后的T细胞、B细胞、DC细胞、单核细胞上表达，说明B7-H4在免疫应答中发挥着重要的作用。B7-H4可以通过抑制T细胞的激活、增殖，抑制细胞因子释放和T细胞毒作用，对免疫应答产生影响，参与肿瘤免疫逃逸。实验证明，敲除肿瘤细胞上B7-H4基因的表达，可以促进肿瘤细胞的凋亡，而过表达B7-H4则可以保护肿瘤细胞，减少调亡。因此，B7-H4的表达和肿瘤的诊断、治疗和预后密切相关，通过阻断B7-H4分子来阻断B7-H4的抑制信号通路，可以提高T细胞的免疫应答反应，打破肿瘤细胞的免疫耐受，阻断肿瘤细胞免疫逃逸，为肿瘤的免疫治疗提供新策略。

B7-H4蛋白属Ⅰ型跨膜糖蛋白，由信号肽区、一对VC免疫球蛋白胞外段、跨膜区和胞浆区组成，共282个氨基酸，通过GPI铆定于细胞膜，其中IgV区为54-130位氨基酸。研究发现，B7-H4IgV样区与MHC分子轻链可变区作用相似，B7-H4主要通过其IgV样区与受体相结合，从而抑制T细胞的增殖、细胞因子的释放和细胞毒作用，对T细胞的免疫应答发挥抑制性调节作用，因此B7-H4IgV样区可作为核酸疫苗抗原表位基因。