[发明专利]基于BGISEQ-500的微量血小板RNA测序检测试剂盒

说明书

本发明公开了基于BGISEQ‑500的微量血小板RNA测序检测试剂盒。本发明提供了一种基于BGISEQ‑500的血小板RNA测序文库构建方法，包括如下步骤：1)提取待测样本的血小板RNA，反转录得到dscDNA；2)用包埋接头的Tn5转座酶片段化所述dscDNA，得到片段化产物；3)对所述片段化产物进行PCR扩增，得到扩增产物；4)环化所述扩增产物，得到血小板RNA测序文库。实验证明，本发明采用低于1ml的全血，进行微量血小板mRNA文库构建,通过自主搭建的血小板分析流程，进行高灵敏性和高特异性的肿瘤早期筛查。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于BGISEQ-500的微量血小板RNA测序试剂盒。

背景技术

癌症是全球发病和死亡的主要原因，2012年全球约有1400万新发癌症病例和820万例癌症相关死亡病例。2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球癌症发病人数的20％，居世界首位；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的1/4。在未来20年中，估计全球每年癌症病例将由2012年的1400万上升到2200万。恶性肿瘤治疗困难，医疗费用高。很多患者在发现癌症之时已经到了晚期，失去了治疗的最佳时机。因此，肿瘤早期诊断对于癌症预防及治疗具有极其重要的作用。

目前，传统的肿瘤诊断方法主要包括有影像学、内窥镜技术及组织病理学，并且一直构成了国际癌症诊断领域的主要部分，也是肿瘤确诊的主要诊断方法。但是这些诊断方法具有早期肿瘤检测灵敏度低、耗时长及对病人损害较大，从而使许多病人错过了癌症的最佳治疗时机。发展低成本、易操作、便携式、低损伤、高准确性和快速的肿瘤早期检测方法是当前所急需。

“液体活检”具有其他筛查方法不具有的低侵入性、覆盖所有肿瘤类型、能够随时检测肿瘤变化，在肿瘤的早期筛查、动态检测及治疗中被寄予厚望。“液体活检”在肿瘤的早期检测、动态监测及治疗中应用解决了部分肿瘤筛查的问题。目前有多种非侵入性血液标记应用于肿瘤的检测，例如血浆游离循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞，外泌体和循环蛋白质。在肿瘤中血浆游离DNA突变的检测一直都是研究的重点，主要利用高通量测序技术，对于血浆游离DNA进行测序，通过游离DNA中肿瘤DNA的突变信息进行极其高的测序深度才能完成检测，同时要求样本量较高，目前无法应用于普通人群筛查。

血小板是血液中含量第二的细胞，是由骨髓中成熟的巨噬细胞的细胞质脱落而成的。血小板不仅在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中发挥着重要作用，而且对癌症的发展及转移也起着重要作用。近年来的研究显示，肿瘤血小板检测可能会使基于肿瘤血液的癌症诊断变得更有效。但现有技术中，还没有对应成熟的技术利用肿瘤血小板对肿瘤进行较为准确的诊断。

目前血小板应用于癌症诊断的技术有多种，包括血小板蛋白检测，血小板RNA定量PCR检测。血小板蛋白检测的不足点为：取样量多，检测准确性低；血小板RNA定量PCR检测的不足点为：检测基因数有限、检测准确性低。

发明内容

本发明一个目的是提供一种基于BGISEQ-500的血小板RNA测序文库构建方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)提取待测样本的血小板RNA，反转录得到dscDNA；

2)用包埋接头的Tn5转座酶片段化所述dscDNA，得到片段化产物；

所述包埋接头的Tn5转座酶中的接头为接头1和接头2；

所述接头1由引物A和引物B退火得到；

所述接头2由引物A和引物C退火得到；

所述引物A的核苷酸序列为序列1；

所述引物B的核苷酸序列为序列2；

所述引物C的核苷酸序列为序列3；