[发明专利]一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术和诊断试剂技术领域，尤其涉及一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒。

背景技术

棘球蚴是由棘球属绦虫(Echinococcus)的幼虫寄生于人畜的肝、肺等脏器而引起严重危害人体健康和畜牧业发展的人兽共患的寄生虫病。棘球蚴病呈世界性分布，不仅能感染牛、羊、猪、马、骆驼等家畜以及多种野生动物，而且也能感染人体，其已成为世界范围一个重要的影响公共卫生和经济的问题，因而受到人们的广泛关注。我国是该病发病最高的国家之一，以我国西部的新疆、青海、甘肃、宁夏、西川北部等地最为严重，调查显示，棘球蚴病流行区面积占全国总面积的44％以上，严重影响西部农牧民的身体健康，是造成西部农牧区因病致贫、因病返贫的重要原因之一。

细粒棘球蚴是棘球蚴的一种，细粒棘球蚴对动物机体的危害主要是对脏器的机械性压迫作用和毒素作用导致的脏器萎缩和机能障碍。动物的临床症状随寄生部位和感染数量的不同差异明显，轻度感染或初期症状均不明显。由于棘球蚴包囊在宿主体内不断生长，不仅压迫周围组织使之萎缩和功能障碍，还易造成继发感染，如果包囊破裂，可引起过敏反应，往往造成宿主严重的病症，甚至死亡。

在棘球蚴病防治中，关键环节在于控制动物棘蚴病传染源、切断生活史循环链。一方面，要对流行区的犬等终末宿主进行定期全面的驱虫管理；另一方面，需要对流行区牛、羊进行免疫预防。

Lightowler等人研制了抗细粒棘球绦虫虫卵感染的Eg95疫苗，Eg95重组蛋白疫苗是目前控制棘球蚴病唯一的疫苗，且临床试验证实其能够用于动物的免疫预防，但多采用原核表达系统对其免疫效果进行检测，其特异性和灵敏性较差，目前尚无报道在Eg95基因的前后分别连接标签序列，通过双标签及真核表达系统来评价Eg95疫苗免疫效果的特异性、敏感性检测试剂盒，因而研究开发易于操作的、特异性强的Eg95疫苗免疫学检测试剂盒，对于促进Eg95重组蛋白疫苗的推广应用具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，能够用于羊棘球蚴病抗体的定性检测，具有特异性强、敏感性高、重复性好、易于操作的优点。

本发明是这样实现的，一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括细粒棘球绦虫重组抗原Eg95蛋白预包被酶标板、血清稀释液、酶标记结合物稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶标记结合物、洗涤液、底物显色液和终止液；所述细粒棘球绦虫重组抗原是通过以下方法制备的：首先PCR扩增Eg95基因片段，并在Eg95基因的前后分别连接His标签序列和Myc标签序列，然后采用EcoRI和XhoI同时酶切PCR产物和真核表达载体pPIC9K，胶回收目的片段和载体后进行连接，构建重组质粒pPIC9K-(His-Eg95-Myc)，再将重组质粒转化到毕赤酵母GS115菌，经甲醇诱导表达，经Ni-NTA纯化。

进一步，所述细粒棘球绦虫重组抗原的包被的方法为：将纯化的重组蛋白Eg95用包被缓冲液稀释至5μg/mL，包被酶标板，每孔加100μL，4℃过夜，用洗涤液洗涤3次，每次2min；然后加入含质量分数5％脱脂奶粉的PBS封闭液，每孔加200μL，37℃孵育2h，随后用洗涤缓冲液洗涤3次，每次2min，真空包装后置于4℃保存备用。

进一步，所述血清稀释液为含BSA和0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液，血清稀释度为1:100，血清反应条件为37℃2h。

进一步，所述阴性对照液为健康未免疫棘球蚴Eg95疫苗的羊血清，所述阳性对照液为含有Eg95抗体的羊血清。

进一步，所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG酶标抗体，所述酶标记结合物稀释度为1:7500，反应条件为37℃下反应30min。

进一步，所述洗涤液为含质量分数0.5‰Tween-20的磷酸盐缓冲液。

进一步，所述底物显色液的配方为：每500mL加乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50mL和TMB粉末0.15g。

进一步，所述底物显色液反应条件为37℃下反应10-15min。

进一步，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。