[发明专利]一种抗蓝耳病Marc-145细胞系及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种抗HP-PRRSV病毒Marc-145细胞系的构建方法，其特征在于，利用CRISPR/CAS9基因编辑技术，筛选针对外显子7的上下游gRNA，将Marc-145细胞系的CD163胞外域SRCR5第7个外显子敲除，共转染Marc-145细胞，通过双荧光筛选系统，获得CD163受体胞外第5个结构域SRCR5删除的Marc-145细胞系；所用gRNA序列如SEQ ID NO.2～3所示；所述CD163基因第7个外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；同时CD163基因表达不受影响，得到抗HP-PRRSV病毒Marc-145细胞系；

具体地，所述构建方法步骤如下：

S1将引导Cas9蛋白靶向切割活性最高的，序列分别如SEQ ID NO.2和3所示的两条sgRNA，分别变性退火成双链寡核苷酸片段，并在片段两侧加上磷酸基团；

S2将步骤S1所得两个双链寡核苷酸片段分别克隆到带EGFP绿色荧光蛋白标签的Cas9与sgRNA共表达载体PX458，和带有DsRed红色荧光蛋白标签的Cas9与sgRNA共表达载体PX459上，获得两个载体，即获得双荧光筛选系统；

S3将步骤S2构建好的两个载体共转染Marc-145细胞，通过流式细胞仪将红色荧光与绿荧光双阳性的细胞群分选出；

S4分选前准备96孔板若干个，对每个96孔板每孔加入150μL预热的条件培养基，所述培养基通过50％新鲜全DMEM和50％已使用全DMEM混合过滤制备；分选后，细胞培养三天后，每孔加入50μL全DMEM培养基，一周后显微镜下观察细胞单克隆情况，并作相应标记，更换培养基；

S5细胞单克隆堆积生长状态下，需要进行胰酶消化，所述胰酶为10μL，加入培养基继续培养，待96孔板长满进行48孔板扩大培养，直至长至6孔板后，进行冻存和基因型鉴定，获得CD163第5个结构域SRCR5双敲纯合子；

步骤S1中反应程序为37℃，30min；95℃，5min；-5℃/min降至25℃；

步骤S2中所用酶切位点为BbsI；

步骤S3共转染的条件：电压：1050V，脉冲：30ms，电击次数：2次。

2.根据权利要求1所述方法构建得到的抗HP-PRRSV病毒Marc-145细胞系。

3.权利要求2所述抗HP-PRRSV病毒Marc-145细胞系在作为HP-PRRSV病毒研究模型或在HP-PRRSV病毒抗性猪的筛选与培育方面的应用。