[发明专利]一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒及其构建方法在审
申请号: | 201711372777.0 | 申请日: | 2017-12-19 |
公开(公告)号: | CN108384803A | 公开(公告)日: | 2018-08-10 |
发明(设计)人: | 冼学进 | 申请(专利权)人: | 上海百力格生物技术有限公司 |
主分类号: | C12N15/85 | 分类号: | C12N15/85;C12N15/66 |
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地址: | 201111 上海市闵*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 质粒 构建 人源 小鼠 大鼠 筛选 干扰载体 转录 蛋白表达 功能筛选 目标序列 特异序列 大鼠类 负调控 实验组 同源 数据库 调控 | ||
1.一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒,其特征在于:所述质粒miRNA序列与人源、小鼠和大鼠数据库中已公布的序列不存在同源,所述质粒作为人源、小鼠和大鼠miRNA干扰的对照组实验,有较准确的对照参照组实验意义,所述质粒含有经过特异筛选的目标序列,目标序列为CCTAGGTTAAGTCGCCCTCGT。
2.根据权利要求1所述的一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒,其特征在于:所述质粒转录出的miRNA不对人源、小鼠和大鼠的蛋白表达起正调控或者负调控作用,是实验组的miRNA干扰作用能较明显的做出判断,从而筛选到理想的miRNA。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒,其特征在于:miRNA干扰载体表达出的miRNA具有经过基因工程改良的骨架结构,其中靶向结合序列进一步剪切成熟后结合目标基因miRNA发挥干扰作用。
4.根据权利要求1或2所述的一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒,其特征在于:所述质粒针对靶基因miRNA的干扰载体,在转染效率>80%的前提下,对实验中的转录水平无明显干扰作用。
5.根据权利要求1所述的一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒的构建方法,其特征在于:所述构建方法包括如下步骤:
(1)预测一段21bp的序列,对人源、小鼠和大鼠的数据库用局部序列比对基本检索工具blast进行比对检索,找到大于90%特异与人源、小鼠和大鼠数据库的序列;
(2)筛选到预测的21bp序列进行合成构建,载体骨架选用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体;
(3)构建好质粒后进行转录后水平表达测试,细胞系选用较常规的HEK293进行干扰实验;
(4)收集细胞株进行Qpcr检测,检测结果显示对人源、小鼠和大鼠的目标蛋白无明显干扰作用,目标蛋白正常表达。
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