[发明专利]牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒，通过对牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌进行比较基因组学分析，筛选出其种间特异基因；多重PCR反应最佳退火温度为54.5℃；最佳循环次数30次；可同时进行三种病原菌的检测；多杀性巴氏杆菌最低检测浓度10^‑2ng/μL，溶血曼氏杆菌最低检测浓度10^‑1ng/μL，牛支原体最低检测浓度10¹ng/μL；构建的特异基因PCR‑ELISA检测方法，对牛呼吸系统疾病主要病原的快速诊断得到良好效果。

技术领域

本发明属动物疾病检验检测技术领域，具体涉及牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒。

背景技术

近年来，牛呼吸系统疾病已经成为危害我国肉牛养殖的主要疾病之一，该病多发于经长途运输的育肥架子牛，具有较高的发病率和死亡率。据统计，在我国该病单场发病率高达60%，病原感染后造成严重的后果，如牛肺部出现纤维素化，胸腔器官粘连，肺部脓肿或形成慢性，不致死，但可导致广泛、持久地肺部损伤，治疗效果差，易复发。动物存活下来，生产性能也低下，严重影响了我国畜牧业的健康发展。

在牛支原体感染动物机体造成机体损伤，同时在各种条件的应激下，机体免疫力下降严重，促使了其他条件性致病菌的混合感染，并增强了其他病原微生物对动物机体的侵蚀损伤能力。混合感染的常见病原主要有多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌等。但上述病原均为苛养菌，具有难分离、难培养等特点，目前，国内外的确诊方法主要集中在病原体的分离鉴定、血清学检测、基因诊断三个方面。鉴于M.bovis分离鉴定难度大、灵敏性低等缺点，不能做为早期快速诊断M.bovis感染的方法，也难以作为常规检查方法普及。应用常规的诊断方法诊断多杀性巴氏杆菌Pm虽然具有许多优点，但由于Pm抵抗力不强，在直射阳光、干燥、无菌蒸馏水和生理盐水中迅速死亡，且诊断时存在费时、费力、敏感性低、漏诊、误诊的缺点。因此，开发一套可快速、准确鉴定上述病原的方法已迫在眉睫。

随着后基因组时代的到来，比较基因组分析已为差异基因的比较和特异性基因的筛选奠定了基础，我们可通过Genbank已登录的全基因组序列，筛选出种间特异基因，进一步通过种间特异基因构建相关病原菌鉴定方法。其中，基于特异基因的PCR-ELISA技术，因其具有PCR的高敏感性、探针的特异性、酶标仪直接读取结果的客观性等优点已成为当前兽医临床检测病原的重要手段。通过对牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌进行比较基因组学分析，筛选出其种间特异基因，进一步构建特异基因的PCR-ELISA检测方法，对牛呼吸系统疾病主要病原的快速诊断具有重要意义。

发明内容

本发明目的是提供一种能够快速诊断鉴别牛支原体M.bovis、多杀性巴氏杆菌Pm、溶血曼氏杆菌Mh的多重PCR-ELISA检测试剂盒。

牛呼吸系统疾病三种病原菌的检测试剂盒，它是牛支原体M.bovis、多杀性巴氏杆菌Pm、溶血曼氏杆菌Mh多重PCR-ELISA检测试剂盒；

所述的检测试剂盒包括下述引物和探针：

OPPD/F：TTTTAGCTCTTTTTGAACAAAT

OPPD/R：GGCTCTCATTAAGAATGTC

Po-probe：CACCAAAAATACAAAGACCAAAAGA

kmt-1F：ATCCGCTATTTACCCAGTG

kmt-1R：CTACCGACAAGCCCACTC