[发明专利]一种成团泛菌来源的苯丙氨酸氨基变位酶的突变体

说明书

本发明公开了一种成团泛菌来源的苯丙氨酸氨基变位酶的突变体，属于酶工程技术领域。本发明的苯丙氨酸氨基变位酶的突变体序列如SEQ ID NO.2所示，该突变酶在50℃处理1小时仍有60％残留酶活性，相比野生酶有了较大的温度稳定性提高。同时该突变体也具备了更好的pH稳定性，有利于以后的工业生产。

技术领域

本发明涉及一种成团泛菌来源的苯丙氨酸氨基变位酶的突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

苯丙氨酸氨基变位酶(PAM)可用于催化苯丙氨酸发生异构化，催化α-苯丙氨酸转氨基变为药用价值更高的β-苯丙氨酸，β-苯丙氨酸是合成抗癌药物紫杉醇的重要前体，具有广阔的市场前景。但是，该反应是一个放热的过程，所以生产过程中高温会影响酶活的发挥，主要是温度高，影响酶的结构，导致酶活下降，进而导致了大量的能耗，提高了生产成本。在生产催化过程中，提高苯丙氨酸氨基变位酶的热稳定性尤为重要。

目前的苯丙氨酸氨基变位酶主要来源于成团泛菌(Pantoea agglomerans)，海洋链霉菌(Streptomyces maritimus)和中华红豆杉(Taxus chinensis)，目前中华红豆杉来源的目的基因在原核生物中表达不够理想，海洋链霉菌来源的基因在温度较高时表现出苯丙氨酸裂解酶活性。因此，选择来源于成团泛菌(Pantoea agglomerans)获得一种稳定性提高的苯丙氨酸氨基变位酶对于β-苯丙氨酸的工业化生产具有重要的应用价值。

发明内容

本发明旨在提供一种耐热性能与酶活都提高的苯丙氨酸氨基变位酶突变体及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种苯丙氨酸氨基变位酶突变体，包括SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的细胞。

本发明的第五个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ IDNO,2所示的苯丙氨酸氨基变位酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌BL21为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET28a。

本发明的第六个目的是提供一种提高苯丙氨酸氨基变位酶稳定性的方法，所述方法是将苯丙氨酸氨基变位酶第114位氨基酸突变为精氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将SEQ ID NO.3所示的苯丙氨酸氨基变位酶第114位赖氨酸突变为精氨酸

本发明的第七个目的是提供一种重组表达所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的方法，将表达所述苯丙氨酸氨基变位酶突变体的基因工程菌接种于LB培养基中，35～37℃培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于20～22℃诱导16-18h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌接种于含卡那霉素的LB表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至0.1mM，20℃诱导16-18h，表达苯丙氨酸氨基变位酶突变体酶。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括收集所述基因工程菌的菌体，将菌体破碎后收集上清，将上清膜过滤后，用His Trap HP柱分离得到苯丙氨酸氨基变位酶突变体。