[发明专利]一种耐酸性提高的纳豆激酶

说明书

本发明公开了一种耐酸性提高的纳豆激酶，属于蛋白质工程。本发明得到的纳豆激酶Q59E‑Y217K‑N218D和Y217K，在酸性条件下，Q59E‑Y217K‑N218D和Y217K的稳定性较野生酶有大幅度提高。本发明提供的纳豆激酶突变体Q59E‑Y217K‑N218D和Y217K能更好的应对胃道极端酸性环境，提高了纳豆激酶作为治疗心脑血管疾病口服药物的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种耐酸性提高的纳豆激酶突变体，属于蛋白质工程。

背景技术

纳豆激酶(NK,EC3.4.21.62)，是日本传统食品纳豆在发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，相较于市售溶栓药物，具有高效溶血栓作用，是最具潜力的纤溶蛋白酶。因此将其开发为可口服药物具有广阔的应用前景，然而由于胃道的极端酸性环境，严重限制了该酶的工业应用。现有的纳豆激酶耐酸性差，急需一种耐酸性提高的纳豆激酶突变体，以适应胃道的极端酸性环境，促进纳豆激酶作为溶栓药物的开发与应用。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种耐酸性提高的纳豆激酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的纳豆激酶的多个氨基酸位点进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的纳豆激酶的第59位、第217位、第218位的一个或多个氨基酸位点进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的纳豆激酶的第217位酪氨酸突变为赖氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的纳豆激酶的第59位谷氨酰胺突变为谷氨酸，同时将第217位酪氨酸突变为赖氨酸和218位天冬酰胺突变为天冬氨酸，得到组合突变体Q59E-Y217K-N218D。

本发明的第二个目的是提供一种表达纳豆激酶突变体的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建方法为：将纳豆激酶突变体的基因连接在载体pET24a上，以大肠杆菌BL21位宿主，构建重组菌。

本发明的第三个目的是提供一种表达纳豆激酶突变体的方法，具体步骤如下：

(1)将重组菌接种于含卡那霉素的LB培养基，35-38℃、150-250r/min振荡过夜培养得到种子液。

(2)将种子液按质量分数为1-2％的接种量分别接种于含卡那霉素浓度的表达培养基中，35-38℃、150-250r/min振荡培养至OD₆₀₀至0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG，于15-18℃诱导18-24h纳豆激酶突变体的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述卡那霉素的浓度为80-120μg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂IPTG至0.05-0.2mM。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂IPTG至0.1mM

在本发明的一种实施方式中，所述表达培养基为TB培养基，所述TB培养基组分为：胰蛋白胨10-14g/L,酵母提取物20-26g/L，甘油3-8g/L，KH₂PO₄2.0-2.6g/L，K₂HPO₄·3H₂O15.8-16.8g/L，CaCl₂0.15-0.25g/L，余量为水。

在本发明的一种实施方式中，所述纳豆激酶的纯化过程：将重组菌体破碎后，收集上清，上清膜过滤后，在2-6℃下，用镍柱离心柱分离得到纳豆激酶突变体纯酶液。