[发明专利]一种对羟基苯甲酰-COA硫酯酶及其制备方法在审
| 申请号： | 201711377198.5 | 申请日： | 2017-12-19 |
| 公开（公告）号： | CN108048425A | 公开（公告）日： | 2018-05-18 |
| 发明（设计）人： | 宫春杰;童心语;薛栋升;胡征;杨波;王毅 | 申请（专利权）人： | 湖北工业大学 |
| 主分类号： | C12N9/16 | 分类号： | C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;G01N33/573 |
| 代理公司： | 武汉开元知识产权代理有限公司 42104 | 代理人： | 王和平 |
| 地址： | 430068 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 羟基 苯甲酰 coa 硫酯酶 及其 制备 方法 | ||
1.一种对羟基苯甲酰-COA硫酯酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶。
3.如权利要求2所述的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.包含权利要求2或3所述对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述载体的构建方法为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的编码基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子下游并受其调控，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-HCTE。
6.包含权利要求2或3所述对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因PCR扩增的引物序列。
7.根据权利要求6所述的引物序列，其特征在于：所述引物序列的正向引物如SEQ IDNO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4。
8.一种制备权利要求1所述的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的编码基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-HCTE；
2)将上述重组载体转化大肠杆菌BL21感受态，得到重组菌株Ecoli BL21-pET21a-HCTE；
3)将Ecoli BL21-pET21a-HCTE扩大培养，诱导表达对羟基苯甲酰-COA硫酯酶，收集菌体；
4)菌体破碎后，通过Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化后得到纯化的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶。
9.一种制备和检测权利要求1所述的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶鼠来源的多克隆抗体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)纯化后的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶注射小鼠，采集血清；
2)用步骤1)中得到的血清通过ELISA进行抗体对抗原的效价；
3)步骤2)中的测得的效价符合条件，即进行抗体纯化；
4)将步骤3)中纯化得到的抗体与对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的原始菌株的破碎液进行Western Blotting检测。
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