[发明专利]一种胰蛋白酶的提取方法及含有胰蛋白酶的原料药

权利要求书

1.一种胰蛋白酶的提取方法，其特征在于，包括有如下步骤：

步骤一：将动物胰脏预处理去除结缔组织和脂肪，切块搅碎，得到胰糜；

步骤二：将胰糜加入到提取罐中加乙酸酸化水至浸没胰糜，搅拌混合后，得到胰糜-水混合物；

步骤三：将胰糜-水混合物离心至分层，并对沉淀进行压滤，将压滤得到的清液与离心得到的上清液混合后得到胰脏提取液；

步骤四：对胰脏提取液进行超滤浓缩后，分别加入30g/L（NH₄）₂SO₄溶液、60g/L（NH₄）₂SO₄溶液、饱和（NH₄）₂SO₄溶液和固体（NH₄）₂SO₄进行梯度盐析，得到胰酶混合物；

步骤五：将胰酶混合物经过压滤后取滤饼，均匀向滤饼中加入0.1mol/L CaCl₂溶液至滤饼完全溶解，通过5mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，过滤去除沉淀后加入胰蛋白酶晶体进行激活，得到胰酶粗提液；

步骤六：将胰酶粗提液压滤后取上清液再次超滤浓缩，得到胰酶浓缩液；

步骤七：活化Sepharose 4B并与鸡卵粘蛋白偶联，将Sepharose 4B-鸡卵粘蛋白混合物装柱，并通过Tris-HCl缓冲液平衡；

步骤八：将胰酶浓缩液过柱去除杂蛋白，用0.1mol/L甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脱，收集位于洗脱峰的流出液，得到胰蛋白酶精提液；

步骤九：将胰蛋白酶精提液脱盐过滤后，冻干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制剂；

步骤一中对胰脏的预处理包括有如下步骤：

Step1，剥除胰脏的脂肪和结缔组织后，将胰脏切割成块；

Step2，通过绞肉机将胰脏块绞成糜状的胰碎；

Step3，将胰碎浸没在碱性脱脂剂中，搅拌脱脂；

Step4，滤去碱性脱脂剂后，用pH=3.0的乙酸酸化水冲洗2~3次，得到胰糜；

所述碱性脱脂剂包括有占碱性脱脂剂总含量0.5mol/L的磷酸三钠、1mol/L的丙酮、1mol/L的乙酸乙酯和0.05mol/L的氯化钙。

2.根据权利要求1所述的一种胰蛋白酶的提取方法，其特征在于，步骤七中Sepharose4B的活化包括如下步骤：

Step1，将Sepharose 4B用1mol/L NaCl溶液滤洗2~5次，再用去离子水冲洗1~2次，冻干成粉状；

Step2，将1.5mL环氧氯丙烷、6.5mL 2mol/L NaOH溶液、7mL去离子水、9mL二甲基亚砜混合配制活化液，将活化液水浴加热至40℃；

Step3，将Sepharose 4B干粉加入到活化液中，水浴状态下搅拌1.5h；

Step4，抽滤除去 活化液，得活化Sepharose 4B。

3.根据权利要求1所述的一种胰蛋白酶的提取方法，其特征在于，步骤七中Sepharose4B与鸡卵粘蛋白偶联包括有如下步骤：

Step1，将pH9.5的Na₂CO₃缓冲液在40℃水浴中水浴加热；

Step2，至Na₂CO₃缓冲液温度恒定后，加入鸡卵粘蛋白至混合均匀；

Step3，将活化Sepharose 4B边搅拌边加入到鸡卵粘蛋白-Na₂CO₃混合液中，持续搅拌24h；

Step4，过滤除清液，完成Sepharose 4B与鸡卵粘蛋白的偶联。

4.根据权利要求1所述的一种胰蛋白酶的提取方法，其特征在于，步骤七的Tris-HCl缓冲液的pH为8.0。