[发明专利]一种克隆草地早熟禾谷氨酰胺合成酶PpGS1基因的方法

说明书

本发明属于生物技术育种领域，公开了一种克隆草地早熟禾谷氨酰胺合成酶基因PpG基因的方法,方法包括：(1)通过电子克隆获得PpGS1基因的部分cDNA序列，长度为1065bp。(2)以cDNA序列为靶标序列，设计特异引物，通过RT‑PCR技术进行扩增。(3)通过琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物。并将回收的特异产物连接到pEasy cloning vector载体上，转化感受态细胞，对阳性克隆进行测序，得到草地早熟禾PpGS1基因的部分cDNA序列，与电子克隆长度一致。(4)根据克隆得到的部分cDNA序列，设计特异引物，利用Clontech公司的SMART^TM RACE技术原理进行cDNA末端扩增，所获得的PpGS1cDNA全长为1451bp。(5)实时荧光定量PCR技术检测表明PpGS1基因具有组织特异表达性。

技术领域

本发明属于生物技术育种领域，具体涉及克隆草地早熟禾谷氨酰胺合成酶PpGS1基因的方法。

背景技术

草坪草是园林绿化建设中不可或缺的植物材料，是衡量一个国家、一个现代化城市文明程度和绿地水平的标志之一。草坪草不仅对维护生态平衡、净化空气、改善小气候、减轻城市热岛效应起着重要的作用，同时为人们提供了舒适的交流活动、运动健身、休闲娱乐的场所，并在摩崖石刻、花卉树木、山石水体等人文景观的映衬下，为城市景观增添了更多的生机活力与艺术美感。草地早熟禾(学名：Poa pratensis L.英文名：Kentuckybluegrass) 属于禾本科(Gramineae)、早熟禾系(Poatae)、早熟禾属(Poa L.)的多年生冷季型根茎-疏丛型禾草，是寒带地区优良品质的冷季型草坪草，具有良好的坪用性状和很高的观赏价值。充足的氮素营养是直接影响草坪植物品质的重要因素，作为我国三北区(包括东北、西北和华北) 被广泛利用的草坪植物，优质高产的草地早熟禾需要大量的氮素营养。但是，目前我国化学氮肥的当季利用率较低，长期利用率也不超过50％，既有一半以上的的氮肥损失。这部分损失的氮肥不仅会造成经济和资源的浪费，还会引起水源和大气污染等环境安全问题。因此，提高草地早熟禾氮素营养利用效率不但有利于提高其品质和观赏价值，而且还对生态环境的维护具有重要意义。

高等植物主要以无机氮的形式从外界环境中吸收氮源，但是，被吸收后的无机氮不能被直接用以生命代谢活动，而是先经过氮同化的反应过程转化为有机氮才能被植物细胞所利用。在氮同化的过程中，植物细胞先将无机氮全部转化为NH₄⁺。细胞中自由存在的NH₄⁺会对生物体产生毒性，当细胞代谢产生多余的NH₄⁺时，谷氨酰胺合成酶(Glutaminesynthetase， GS)催化NH₄⁺和谷氨酸(Glu)反应，将无机氮形式的NH₄⁺转化为有机氮形式的谷氨酰胺 (Gln)，消除NH₄⁺对细胞的伤害，同时提高植物对氮素营养的利用效率。

GS的分子生物学研究始于1983年，从蓝细菌Anabaena(glnA)克隆到GS并完全测序分析。之后在植物中进行了GS-cDNA和基因组GS-gDNA的克隆，从它们的核苷酸顺序推算出GS亚基的一级结构，并用于研究组织、结构及演化和基因表达。

目前，国内外有关谷氨酰胺合成酶基因的获得和应用在一些植物研究上有报道(Jan K. Schjoerring etal，2009，Cloning,characterization and expressionanalysis of tonoplast intrinsic proteins and glutamine synthetase in ryegrass(Lolium perenneL.))，但针对草地早熟禾谷氨酰胺合成酶(GS)基因全长cDNA序列的获得和应用还尚未有报道。

发明内容