[发明专利]一种人Ro52重组蛋白的制备方法

说明书

本发明涉及一种人Ro52重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：步骤（1）、人工合成人Ro52基因并亚克隆至原核表达载体得到重组载体；步骤（2）、将步骤（1）得到的所述的重组载体经转化进入原核表达系统中得到转化子；步骤（3）、将步骤（2）得到的所述的转化子在培养基中培养得到表达菌；步骤（4）、将步骤（3）得到的所述的表达菌经亲和层析获得所述的人Ro52重组蛋白。本发明通过采用原核表达系统以及通过对工艺参数的控制，使得人Ro52重组蛋白的制备方法简单易操作、成本低、产量高（1L诱导表达量可获得2.95mg的人Ro52重组蛋白），并且人Ro52重组蛋白的纯度高（>90%）。

技术领域

本发明属于基因工程和生物工程技术领域，具体涉及一种人Ro52重组蛋白的制备方法。

背景技术

用可溶性组织抗原和干燥综合征 (Sjfgren'ssyndrome)患者血清进行免疫扩散实验时发现了2种特异性抗原，命名为干燥综合征A 型抗原和B型抗原，随后发现干燥综合征A型抗原(SSA)由2 种蛋白组成，分别称为Ro52 和Ro60。Ro52是多种自身免疫疾病的靶抗原，如系统性红斑狼疮、干燥综合征、系统性硬化症和皮肌炎等，抗Ro52抗体也是新生儿先天性心脏传导阻滞的重要疾病原因。多项研究表明，干燥综合征患者血清中存在高滴度的抗Ro52抗体，因此研制Ro/SSA抗体检测试剂盒具有重要的临床意义。

研制Ro/SSA抗体检测试剂盒重要的原料就是Ro52蛋白，目前，国内外主要使用组织提取法，从动物（小牛、猪、兔等）胸腺或人脾脏中提取纯化天然自身抗原作为检测相应自身抗体的配体，但此方法存在产量少、纯度低、批间差异大且成本高等缺点。

福建医科大学宋涛发表的硕士学位论文公开了人自身抗原Ro52的酵母重组表达及其抗体检测斑点免疫金渗滤法的建立，其以人白血病MPN细胞的cDNA文库为模板，PCR扩增人Ro52全长基因序列，将PCR产物回收进行TA克隆并鉴定；将测序正确的TA克隆和Ppic9K抽提质粒双酶切后连接，重组质粒经线性化后采用电穿孔法导入巴斯德毕赤酵母SMD1168株中，构建重组Ro52酵母真核表达载体。利用G418筛选高表达的重组菌，并对高表达重组菌进行PCR鉴定；诱导Ro52酵母菌分泌表达获得目的蛋白，经硫酸铵浓缩沉淀，通过SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。其采用的是真核表达载体进行Ro52蛋白的制备，该方法存在操作复杂、周期长、成本高、产量低等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种产量高、成本低的人Ro52重组蛋白的制备方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

本发明的一个目的是一种人Ro52重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1）、人工合成人Ro52基因并亚克隆至原核表达载体得到重组载体；

步骤（2）、将步骤（1）得到的所述的重组载体经转化进入原核表达系统中得到转化子；

步骤（3）、将步骤（2）得到的所述的转化子在培养基中培养得到表达菌；

步骤（4）、将步骤（3）得到的所述的表达菌经亲和层析获得所述的人Ro52重组蛋白。

本发明中，所述的原核表达载体是具有多克隆位点且可通过多个调控原件在原核表达系统进行调控表达外源基因的分子生物学载体。

优选地，所述的原核表达载体为pET-28a (+)载体。

本发明中，所述的原核表达系统是可以表达外源基因的原核细胞。

优选地，所述的原核表达系统为大肠杆菌BL21(DE3)。

优选地，采用化学转染或物理转染将所述的重组载体转化进入所述的原核表达系统中。