[发明专利]用于分析启动子活性的载体以及基于RNA计数的启动子活性分析方法

说明书

本发明公开了一种用于分析启动子活性的载体以及基于RNA计数的启动子活性分析方法，该方法通过在同一个载体上用不同的两个启动子Pa和Pb；分别驱动两个高度相似的DNA序列DNAa和DNAb，体内转录后得到RNAa和RNAb，通过计算DNAa‑PCR产物DNA和DNAb‑PCR产物DNA的数量比，确定Pa对Pb启动子的活性关系。此方法具有精准定量、抗干扰能力强、快速、不受受体材料和物种限制等特点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种用于分析启动子活性的载体以及基于RNA计数的启动子活性分析方法。

背景技术

随着全基因组测序技术、分子生物学、生物信息学的快速发展，有大量的基因被测序和克隆，在功能基因研究中，基因启动子研究分析是主要的组成部分，因而对启动子的活性研究至关重要。常规植物启动子活性分析的方法是通过转基因技术获得稳定的转基因株系，使用Gus作为报告基因，通过染色，根据染色深浅判断启动子的强度，此类技术实验周期长(4-6个月)、无法做到精细定量、工作量大、成本高。

目前对动物细胞启动子活性验证方法多采用双荧光素报告系统，该系统使用两个载体，一个载体上用标准启动子驱动海肾荧光素酶，另一个载体上用待测启动子驱动萤火虫荧光素酶，这两个酶表达后分别可以利用海肾荧光素和萤火虫荧光素发出红色和黄绿色的荧光，通过比较两种荧光的强度，判断启动子的强度，此类技术结果不稳定、不精确，同时对于无法获得单细胞的组织因不能有效吸收荧光素而无法使用，因而在植物中很少应用。此系统是两个载体的系统，不能保证进入细胞的两种载体的比例是严格的1：1，这是第一种产生系统误差的原因；其次，两种不同的荧光素发光系统，发光效率不一致，用不同的测试底物，各自底物的浓度不好确定，这是第二种产生系统误差的原因；最后，此系统不是直接评估与启动子活性直接相关的RNA的数量，而是在蛋白水平评估蛋白活性，从RNA到蛋白翻译的过程中因为密码子翻译效率问题会产生本质的差异，这会给该系统带来最致命的系统错误，而且所用仪器、试剂等成本昂贵。

综上所述，现有的技术存在系统复杂，不直接，不准确，周期长，或者成本高等弊端。

发明内容

本发明针对现有技术存在缺陷，提供了一种用于分析启动子活性的载体以及基于RNA计数的启动子活性分析方法，该方法通过比对启动子直接产物--RNA的数量评估启动子活性，该方法的过程直接，不会引入系统误差。

为实现上述目的，本发明提供的一种用于分析启动子活性的载体，所述载体的骨架上设置有两个转录单元，分别为转录单元A与转录单元B，所述转录单元A包括待比较的参考启动子Pa、DNAa序列和终止子；所述转录单元B包括待比较的目标启动子Pb、DNAb序列和终止子；其中，所述DNAa序列和DNAb序列来源于同一序列，且DNAa和DNAb之间的个别碱基存在差异。

进一步地，所述DNAa序列和DNAb序列均为任意的序列或完整的ORF，所述DNAa序列和DNAb序列优选为完整的ORF，尤其优选常见的报告基因如Gus、Gfp等报告基因。

再进一步地，所述载体为pARC-gfp载体，序列为SEQ ID No.1所示，其中，

它包括以Gfp基因上的一段序列作为DNAa、DNAb序列，分别如SEQ ID No.2和SEQID No.3所示，其具体序列如下：

DNAa：

5’-TTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACGCGAGCTGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACGCTCGTCAACCGTATCGAGCTCAAGGGAATCGACTTCAAGGAGGACGGAAACATTCTCGGACACAAGCTGGAGTACAACTACAACTCCCACAACGTTTACATAATGGCGGACAAGCAGAAGAACGGCATTAAGGCCAACTT-3’；

DNAb：