[发明专利]一种梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法

说明书

本发明提供一种梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法，涉及分离培养细胞领域。为解决培养梅花鹿瘤胃上皮细胞纯度低，活力低，成功率低，易污染等问题，本发明提供的方法步骤如下：取梅花鹿瘤胃组织，用含有抗生素等的PBS缓冲液冲洗；取上皮组织剪碎，加入含有胎牛血清FBS、亚硒酸钠、抗生素等的DMEM/F12培养液贴壁培养；加入含有胎牛血清FBS、亚硒酸钠、抗生素等的DMEM/F12培养液传代培养。按照本发明提供的方法能够首次成功分离出梅花鹿瘤胃上皮细胞，纯度及活性较高并可稳定传代，并且克服了瘤胃内多种微生物带来的污染问题。本发明可应用于梅花鹿瘤胃上皮的生长发育、生理功能及在营养代谢等方面的研究。

技术领域

本发明涉及分离培养细胞领域，特别是培养梅花鹿瘤胃上皮细胞。

背景技术

胃和肠道是动物主要的消化器官，而反刍动物对饲料的消化主要以瘤胃消化为主，所以研究瘤胃上皮细胞的营养物质转运及吸收机制以逐步成为反刍动物营养代谢的热点之一。本发明可以用于梅花鹿瘤胃上皮的生长发育、生理功能及在营养代谢等方面的研究。

原代培养是获得瘤胃上皮细胞的唯一手段，在国内外各大细胞库内瘤胃上皮细胞系均没有销售。瘤胃中含有细菌、真菌、支原体和原虫等微生物，因此，培养细胞的过程中极易受微生物的污染。目前，国内外尚反刍动物瘤胃上皮细胞分离及培养的方法较少，参考已有文献中的瘤胃原代细胞培养进行梅花鹿细胞培养，并不能完全适用于梅花鹿，最终导致原代培养的瘤胃上皮细胞存在着状态不稳定，活力低，成功率低，易污染等缺点。

目前培养瘤胃上皮细胞的方法多用酶消化法，组织块法的应用较少，利用酶消化法收集细胞的效率同物种、组织块的大小、酶的类型、酶的活性及浓度有关，所以已有的专利文献获取瘤胃细胞的方法并不一定适用于培养梅花鹿上皮细胞，并且有相关试验证明利用酶消化法的细胞活性较组织块法的培养低。

因此提供一种可靠的，可行性高的梅花鹿瘤胃上皮细胞培养方法迫在眉睫。

发明内容

为解决上述培养梅花鹿瘤胃上皮细胞纯度低，活力低，成功率低，易污染等问题，本发明提供一种梅花鹿瘤胃上皮细胞培养的方法。

一种分离培养梅花鹿瘤胃上皮细胞的方法，步骤如下：

(1)取梅花鹿瘤胃组织，先将瘤胃内容物用生理盐水清洗干净后，再用含有青霉素、链霉素、庆大霉素、两性霉素B的PBS缓冲液冲洗6-8遍，最后一遍冲洗后，再加入PBS缓冲液并静止10min；

(2)将瘤胃组织的肌层及上皮层分离，取上皮组织备用；

(3)将上皮组织剪碎，将剪碎的组织均匀平铺在培养瓶中，倒置在培养箱中放置2h；

(4)加入含有胎牛血清FBS、EGF、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素、庆大霉素、两性霉素B的DMEM/F12培养液进行贴壁培养；

加入培养液后，3d后观察有细胞爬出，随着时间的推移，8d后细胞数量明显增多。

(5)贴壁培养4天后，弃去培养液，加入含有胎牛血清FBS、EGF、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素的DMEM/F12培养液，继续培养，每隔4-5天换培养液，所述换培养液操作为保留原培养液的1/3-1/2，加入与弃去培养液体积相同的含有胎牛血清FBS、EGF、L-谷氨酰胺、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、青霉素、链霉素的DMEM/F12培养液；细胞铺满培养瓶底部80％以上时的细胞作为第零代细胞；