[发明专利]一种基于荧光分子的内毒素的检测方法

说明书

一种基于荧光分子的内毒素的检测方法，制作LPS的标准曲线，用纯水或PBS作系列稀释，按LPS总积与SO体积比为1︰10或1︰20加入5x的SO，37℃避光反应5～10min，以425nm为激发波长，检测470nm的发射波长的荧光，或进行500～700nm的范围扫描，以LPS浓度为横坐标，以470nm的荧光值为纵坐标，作图，用线性拟合的方式得到线性方程，对于待测样品，可参照与标准曲线同样的反应条件和系统，检测未知样品的荧光值，并由标准曲线方程计算出相应的LPS的含量；通过荧光光谱强弱的变化，则用于检测小分子与LPS是否存在相互作用，若用于定性分析，则可在荧光显微镜下观察有无荧光出现的方式。

技术领域

本发明涉及内毒素脂多糖(lipidopolysaccharides,LPS)，尤其是涉及可用于其含量及定性检测的一种基于荧光分子的内毒素的检测方法。

背景技术

LPS是一种细菌内毒素，是由糖类和脂类组成。存在于革兰氏细菌细胞的表面，参与细菌与宿主细胞的粘附和毒性的产生。通过菌体裂解而进入细胞内，导致休克等中毒症状，不仅如此，在发热及感染等疾病均伴随有内毒素引起的疾病。因而检测其含量无论是对临床诊断和分析检测方面均具有重要的意义。

迄今为止，药典(2010版一部)采用的LPS检测方法如鲎试剂法，其被广泛采用，但是实验需要鲎血，不利于动物保护。因而寻找高效、灵敏和特异性强的小分子检测试剂，具有重要的意义。

Sypro orange(SO)是含有非极性并带有正电荷的小分子化合物，其通过与蛋白质的非极性区域结合从而被用来对蛋白质染色。而LPS其分子中具有脂A的非极性区域，同时其中与糖基结合的磷酸基团带有负电荷，具备与SO特异性结合的潜力。

迄今为止尚未见有关于SO用于LPS的分析检测及其与之相关用途的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于荧光分子的内毒素的检测方法。

本发明的具体步骤如下：

1)制作LPS的标准曲线，用纯水或PBS作系列稀释，按LPS总积与SO体积比为1︰10或1︰20加入5x的SO，37℃避光反应5～10min；

2)以425nm为激发波长，检测470nm的发射波长的荧光，或进行500～700nm的范围扫描；

3)以LPS浓度为横坐标，以470nm的荧光值为纵坐标，作图，并用线性拟合的方式得到线性方程；

4)对于待测样品，参照与标准曲线同样的反应条件和系统，检测未知样品的荧光值，并由标准曲线方程计算出相应的LPS的含量；

5)通过荧光光谱强弱的变化，用于检测小分子与LPS是否存在相互作用，若用于定性分析，则可在荧光显微镜下观察有无荧光出现的方式。

所述制作LPS的标准曲线可以纯水或PBS配制成1mg/mL。

本发明可用于临床和科学研究。

本发明可用于LPS的含量测定及其细胞内外的定性分析。本发明所用的试剂为商品化的Sypro orange(5000x)，中文为宝石橙；商品化的LPS，用于制作标准曲线。本发明所用的仪器如多功能酶标仪(微量的96孔板检测)或荧光分光光度计(用比色皿检测)等用于样品的荧光检测。

研究表明，SO与LPS具有较强的结合作用，LPS可使SO的荧光增强，且呈现剂量依赖的关系。LPS分子带有负电荷且含有非极性较强的脂A，因而可与带有正电荷和非极性的SO通过静电引力和疏水作用进行结合。因而与基于吸收光谱法的鲎试剂法比较，荧光法具有更高的灵敏度，且SO较易获得，因而用SO检测LPS具有潜在的应用价值。

附图说明