[发明专利]人工抗原递呈细胞及其构建方法与在嵌合抗原受体T细胞扩增中的应用

权利要求书

1.一种CD19-CAR T细胞扩增方法，其特征在于，采用人工抗原递呈细胞进行扩增，该人工抗原递呈细胞的构建方法，包括以下步骤：

（1）分别构建包含CD137L、CD86、CD64、mIL-15、CD19的慢病毒表达载体；

（2）将包含CD137L慢病毒表达载体转染相应的细胞，挑单细胞克隆，流式细胞分选，获得CD137L稳定表达的细胞CD137L-aAPC；

（3）在步骤（2）获得的CD137L-aAPC基础上通过包含CD86慢病毒表达载体转染来导入CD86，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86-aAPC；

（4）在步骤（3）获得的CD137L CD86-aAPC基础上通过包含CD64慢病毒表达载体转染来导入CD64，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86 CD64-aAPC；

（5）在步骤（4）获得的CD137L CD86 CD64-aAPC基础上通过包含mIL-15慢病毒表达载体转染来导入mIL-15，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86 CD64 mIL-15-aAPC；

（6）在步骤（5）获得的 CD137L CD86 CD64 mIL-15-aAPC 基础上通过包含CD19慢病毒转染表达载体来导入CD19，挑单细胞克隆，流式细胞分选，建立CD137L CD86 CD64 mIL-15CD19-aAPC；

所述的CD19-CAR T细胞扩增方法包括以下步骤：

（1）制备人外周血单核淋巴细胞，细胞浓度为10⁶cells/ml；

（2）按照1×10⁶cells/ml将人外周血单核淋巴细胞种在培养板中，放于37℃、5%CO₂培养箱中孵育2h，得到细胞悬液；其中，培养板中的培养基为含体积百分浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基；

（3）向预热至37℃的lonza核转染试剂中加入PB-19CAR-puro至终浓度为0.1μg/μl和Super PiggyBac Transposase至终浓度为0.05μg/μl，混合均匀，之后向其中以体积比为1:1比例加入步骤（2）孵育得到的细胞悬液，得到混合液；

（4）用lonza电转仪的U-014程序对步骤（3）得到的混合液进行电转，再以体积比为2:1比例加入预热至37℃的含体积百分浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，接着将细胞转移到培养板中在37℃温箱中孵育2小时；

（5）孵育完成后将细胞转移到离心管中，离心，弃上清，再用含体积百分浓度为10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞制备成浓度为10⁶ cells/ml的细胞悬液并放于培养板中，置于37℃温箱中过夜，得到电转化CAR-T细胞；

（6）次日将CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC细胞用100Gy进行辐照；将辐照后的CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC细胞以数量比为1:2的比例加入到步骤（5）得到的电转化CAR-T细胞中，再加入IL-21至终浓度为30ng/ml和IL-2至终浓度为300IU/ml；在培养第7天、14天、28天，再次以细胞数量比为1:2比例将CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC细胞重复刺激CD19 CAR-T细胞，同时加入30ng/ml 的IL-21和300IU/ml的IL-2；连续培养至28天以获得足够量的CD19-CAR-T细胞。

2.根据权利要求1所述的CD19-CAR T细胞扩增方法，其特征在于，所述CD19-CAR T细胞扩增方法的步骤（2）中，相应的细胞为K562细胞。

3.根据权利要求1所述的CD19-CAR T细胞扩增方法，其特征在于，所述人工抗原递呈细胞为CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-aAPC，其细胞膜表面稳定表达CD137L、CD86、CD64、膜固定白介素15和CD19。

4.根据权利要求1所述的CD19-CAR T细胞扩增方法，其特征在于，所述人工抗原递呈细胞为CD137L CD86 CD64 mIL-15 CD19-K562细胞。