[发明专利]细胞冻存液及其应用

说明书

本发明涉及细胞领域，特别涉及细胞冻存液及其应用。该细胞冻存液，将甘油、丙二醇、海藻糖、蔗糖、人白蛋白、葡萄糖等溶解于PBS缓存溶液中而配制成的。其中，渗透性的保护液有甘油、丙二醇；非渗透性的保护液有海藻糖、蔗糖和人白蛋白。同时使用葡萄糖为细胞提供能量，使用PBS缓冲液维持细胞冻存液的PH的稳定性。成分固定，批次间差异小，不引入细菌和病毒等污染源；同时使用渗透性的和非渗透性的保护液，提供细胞抗冻的能力，提高细胞的存活率；再者加入了葡萄糖为细胞提供能量，进一步提高细胞的存活率；最后使用PBS缓冲液维持细胞冻存液的PH稳定，减少了环境对细胞的影响，提高了细胞的存活率。

技术领域

本发明涉及细胞领域，特别涉及细胞冻存液及其应用。

背景技术

细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，起到了细胞保种的作用。

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用慢冻快融的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1到-2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

冻存保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质(常为溶液)。细胞悬液中加入冷冻保护剂可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合作用，弱化水的结晶过程使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时冷冻保护剂可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。

冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂：可以渗透到细胞内，一般是一些小分子物质，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等；非渗透性冷冻保护剂：不能渗透到细胞内，一般是写大分子物质，主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。

现在常用的细胞冻存方案是使用DMSO为冻存保护剂，同时加入牛血清，这样的方案可以用于科研产品的保存，但是存在细胞毒性、成分不确定、可能引入细菌和病毒等污染源的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种细胞冻存液及其应用。该细胞冻存液减少了环境对细胞的影响，提高了细胞的存活率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了细胞冻存液，包括甘油、丙二醇、海藻糖、蔗糖、人白蛋白、葡萄糖或缓冲液中的一种或两者以上的混合物。

在本发明的一些具体实施方案中，细胞冻存液包括如下组分：