[发明专利]一种磷酸化肽段富集试剂盒及富集方法

说明书

本发明提供一种磷酸化肽段富集试剂盒及其富集方法，属于蛋白质肽段富集技术领域，其通过二氧化钛填料高度特异性地结合肽段上磷酸化基团的特性对蛋白质酶解产物中的磷酸化肽段进行富集，同时优化实验条件和缓冲试剂，能够快速地实现大规模的磷酸化肽段富集，它具有检测灵敏度较高，特异性较强，数据分析结果准确等优点，该试剂盒可广泛适用于蛋白质及多肽类的磷酸化修饰位点确证。

技术领域

本发明属于蛋白质肽段富集技术领域，尤其涉及一种磷酸化肽段富集试剂盒，还涉及一种磷酸化肽段富集方法。

背景技术

蛋白质磷酸化是生物界中最为普遍也是非常重要的一种蛋白质修饰类型，在细胞内，大约有三分之一的蛋白质被认为有磷酸化修饰，蛋白质的磷酸化修饰几乎调节着生命活动的整个过程，包括DNA损伤修复、转录调节、信号转导、细胞凋亡的调节等。磷酸化蛋白质及多肽的研究可帮助我们阐明上述过程的机理，进一步理解生命系统如何在分子水平进行调控，从而认识生命的本质，在对磷酸化蛋白质或者多肽进行研究前必须先对研究对象进行富集，以提高研究的准确性。

当前磷酸化富集的手段有很多种，其中最主要的方法包括使用磷酸化抗体的免疫亲和色谱、离子交换色谱分离磷酸化与非磷酸化肽段、固相金属亲和色谱（immobilizedmetal affinity chromatography, IMAC）和金属氧化物亲和富集技术等。

但磷酸化抗体的免疫亲和色谱由于抗磷酸化抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差；离子交换色谱分离磷酸化与非磷酸化肽段在磷酸化肽所带电荷较多时会造成部分磷酸化肽的丢失；固相金属亲和色谱可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽，同时，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集，影响富集质量。

发明内容

基于现有技术存在上述问题，本发明提供一种磷酸化肽段富集试剂盒及其富集方法，其通过二氧化钛填料高度特异性地结合肽段上磷酸化基团的特性对蛋白质酶解产物中的磷酸化肽段进行富集，同时优化实验条件和缓冲试剂，能够快速地实现大规模的磷酸化肽段富集，它具有检测灵敏度较高，特异性较强，数据分析结果准确等优点，该试剂盒可广泛适用于蛋白质及多肽类的磷酸化修饰位点确证。

本发明通过以下详细技术方案达到目的：

一种磷酸化肽段富集试剂盒，其包括分离柱Tip Column、洗脱液Wash Buffer A、洗脱液Wash Buffer B、洗脱液Elution Buffer C，所述的分离柱Tip Column是使用C18填料为堵头的自填柱；所述的洗脱液Wash Buffer A包括75-85%乙腈、4-6%三氟乙酸和12-18%水，所述的洗脱液Wash Buffer B包括75-85%乙腈、0.05-0.15%三氟乙酸和18-21%水；所述的洗脱液Elution Buffer C包括75-85%乙腈、2-4%氨水和15-19%水；所述的试剂盒的使用方法包括如下步骤：

步骤S10，取Wash Buffer A加入到含0.2-0.4g 的2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；

步骤S20往含有200-400μg的二氧化钛填料的试管中加入Elution Buffer C，Elution Buffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，再加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash buffer A浸没二氧化钛填料，混合均匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，重复多次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；