[发明专利]一种美沙酮免疫检测试剂及其制备和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验领域，具体是一种美沙酮免疫检测试剂及其制备和检测方法。

背景技术

美沙酮（Methadone，MTD），是人工合成的阿片类药物，药效与吗啡类似，具有镇痛作用，并伴有呼吸抑制、缩瞳、镇静等副作用。美沙酮镇痛作用强，持续时间长，口服效果好，适用于慢性疼痛，是当前世界阿片类物质依赖替代疗法中的主要药物，但是，长期重复使用可以产生长期临床效应，可形成躯体依赖性、心理依赖性和耐受性。因此在应用美沙酮治疗时，对美沙酮的成瘾性及滥用倾向不应忽视，必须建立严格管理制度，避免流失而转变为毒品。

目前检测美沙酮的常用方法有：高效液相色谱分析（HPLC）、气相色谱（GC）、质谱（MS)和荧光分光光度法等。其中，HPLC、GC和MS都存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，准确性较差；荧光分光光度法，检测结果准确性差，对样品的纯度要求较高，还需要昂贵的仪器设备。

本发明采用的方法为均相酶免疫检测法，其优点为：操作简便、快速、灵敏度高、准确性好、适合于自动化，应用广泛，并且用全自动生化分析仪对小分子物质和大分子物质都能高通量快速测定。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中美沙酮检测过程操作复杂、以及测定准确度低的问题，本发明提供了一种快速、灵敏度高、准确检测出待测样本中美沙酮含量的美沙酮均相酶免疫检测试剂及其制备方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种美沙酮免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于：酶标美沙酮、用于检测美沙酮抗体-酶标美沙酮复合物的指示试剂；上述酶标美沙酮由美沙酮和葡萄糖脱氢酶偶联而成。

作为本发明进一步的方案，所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-美沙酮偶联物；上述酶的底物为葡萄糖。

作为本发明进一步的方案，所述的一种美沙酮免疫检测试剂及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）葡萄糖脱氢酶-美沙酮偶联物的制备：美沙酮半抗原的制备，葡萄糖脱氢酶（GDH）与美沙酮半抗原偶联，纯化偶联的酶标抗原。

（2）美沙酮均相酶免疫检测试剂的制备：

试剂1的制备：由美沙酮抗体和均相酶底物混合而成；

试剂2的制备：由葡萄糖脱氢酶-抗原偶联物与磷酸盐缓冲液混合而成。

作为本发明进一步的方案，所述的一种美沙酮免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）具体过程为：

1）美沙酮半抗原的制备

a. 将1-10 g美沙酮溶于10-100 mL无水吡啶中，加入乙酸酐，室温静置12小时以上，减压浓缩，蒸干后称重，得产物A；

b. 用20-100 mL二甲基甲酰胺溶解50-150 g产物A，再加入5-30 mL 浓度为1M的盐酸，室温静置12小时以上，然后用乙醚萃取，收集有机相用氢氧化钠水溶液萃取，继续收集有机相减压浓缩，加入少量石油醚，蒸干得产物B；

c. 取适量产物B溶于乙酸酐中，94℃下反应15-30分钟，冷却结晶过夜，再减压蒸干得产物C；

d. 产物C加入95%乙醇和5M氢氧化钠，得到乳白色悬浊物，加入适量纯化水溶解，用少量乙酸调pH至酸性，析出沉淀后过滤，滤渣干燥过夜，得产物D；

e. 称取100-500 mg产物D溶于2-10 mL无水吡啶中，加入100-500 mg丁二酸酐，95-105℃下反应14小时以上，减压蒸干，用38%碳酸钾溶解，再用乙酸乙酯萃取，收集水相，用盐酸调pH至4.8-5.2，然后用乙酸乙酯萃取，收集有机相，减压蒸干，得到美沙酮半抗原。

2）葡萄糖脱氢酶（GDH）与美沙酮的偶联

a. 将5-35 mg上述美沙酮半抗原溶于500-2000 μL2-(N-吗啡啉)乙磺酸中，轻微振荡溶解；取10-45 mg 规格为100-300 KU的GDH溶解于PBS缓冲液中震荡均匀；

b. 将50-150 μL的碳二亚胺（EDC）溶液在搅拌下缓慢滴加到美沙酮半抗原溶液中，旋转混合15-30分钟；

c. 将上述活化好的美沙酮溶液在搅拌下缓慢加入到GDH溶液中，搅拌反应1-2小时。

3）纯化偶联的酶标抗原

通过G-25凝胶层析柱纯化偶联的酶标抗原，得到葡萄糖脱氢酶-美沙酮偶联物，于2-8℃下储存。

作为本发明进一步的方案，所述的一种美沙酮免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体过程如下：