[发明专利]用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针

说明书

本发明公开了用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的方法以及相应的引物和探针。本发明首次建立了一种可快速区分五种不同基因型JEV野毒株(I、II、III、IV、V)与疫苗株SA14‑14‑2的荧光PCR检测方法，该检测方法操作简单，全部操作过程不需3小时，不需要病毒的细胞培养，显著缩短了病毒五种不同基因型野毒株与疫苗株鉴别与检测所需时间，并且准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

技术领域

本发明涉及鉴别猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株技术领域，尤其是用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针、试剂盒以及方法。

背景技术

猪乙型脑炎是由日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)经媒介蚊虫传播的一种人兽共患病，本病在猪群中的自然感染率高，且病毒血症持续时间长，所以猪是JEV主要的扩散和增殖宿主。JEV感染在临床上多以母猪发生流产、死胎、木乃伊胎，公猪发生睾丸炎、不育为特征，给养猪业造成巨大损失。由于目前尚无有效的治疗方案，接种疫苗仍然是预防该疾病流行的最有效方式。

根据JEV结构基因的进化分析，JEV包含5个基因型(I、II、III、IV和V)^【1】，各基因型的分布有一定的区域性。包括中国在内的亚洲目前主要流行I型和III型，II型主要从泰国、马来西亚、澳大利亚、印度尼西亚分离得到，IV和V分布较少，主要来源于印度尼西亚和马来西亚。对JEV进行基因型分析是了解JEV遗传变异、开展分子流行病学研究的基础，为分析JEV流行株的遗传变异、基因型以及与现行使用的疫苗株之间的差异等提供了科学依据。目前对JEV进行基因型分析主要依靠测序后的序列进化分析，其过程复杂且费用较高，因此需要一种快速、简便的方法用于基因型鉴定。而活疫苗SA14-14-2株的使用也给临床JEV感染的检测带来干扰，因此，建立一种疫苗株与野毒株的鉴别检测方法具有重要意义。

关于区分JEV不同基因型的快速检测方法，目前已经报道的有基于逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)^【2、3】、多重RT-PCR技术^【4、5】、基因芯片分型技术^【6】和限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术(RT-PCR-RFLP)^【7】等检测方法，但这些方法都是只针对JEV基因I型和III型的检测方法。而基因II型、IV型和V型在周边国家也有流行，有必要建立长期的监测手段跟踪分析JEV流行进化规律。目前还未检索到针对JEV 5个基因型及疫苗株SA14-14-2的快速检测方法。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能快速区分猪乙型脑炎病毒野毒株与疫苗株的检测方法，该方法操作简易、快速、检测结果可靠，有利于在临床实践中推广应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

作为本发明的第一个方面，本发明提供一种用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下所示：

引物F：5'-TGGAGAAACAGAGARMTC-3'(SEQ ID NO：1)；

引物R：5'-CCAGTTTGTCCATTTTYA-3'(SEQ ID NO：2)；

探针P：5'-CTCAGTGAAGTTAACATCAGGCCAC-3'(SEQ ID NO：3)，其中，所述探针P的5’端结合荧光报告基团，所述探针P的3’端结合荧光淬灭基团，引物F中R为A或G，M为A或C，引物R中Y为C或T。

优选地，所述荧光报告基团为FAM、HEX、VIC、CY5或TET，所述荧光淬灭基团为TAMRA、MGB或BHQ。

作为本发明的第二个方面，本发明提供用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的试剂盒，所述试剂盒含有上述的引物和探针。