[发明专利]一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及其制备方法

说明书

本发明公开了一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒包括：磁微粒偶联的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）捕获抗体、吖啶酯标记的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测抗体、中性粒细胞弹性蛋白酶校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B、清洗液。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系。与现有技术相比，本发明建立的直接化学发光法灵敏度高、特异性强、准确快速，检测时间短，检测结果具有更高的准确性与重复性，该试剂盒可适用于各种发光检测仪器。

技术领域

本发明属于免疫检测分析领域，具体是一种中性粒细胞弹性蛋白酶的免疫化学发光检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）是一种分子量为30000、由218个氨基酸组成的单链糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族。它来源于中性粒细胞，在单核细胞中也有少量的存在。中性粒细胞内的弹性蛋白酶浓度超过 5mM，每个中性粒细胞含有大约 400个弹性蛋白酶阳性颗粒，估计细胞总量在 3pg 以上，并被严格地控制在中性粒细胞嗜苯胺蓝体的颗粒内。当中性粒细胞被激活后，从嗜苯胺蓝颗粒中释放出多种蛋白水解酶，包括丝氨酸酶、弹性蛋白酶等多种蛋白酶，而弹性蛋白酶是其中含量高、作用范围广、水解能力强的蛋白水解酶之一。它能降解细胞外基质，并能引起内皮细胞的分离、溶解或屏障功能破坏。细胞外基质是动脉粥样斑块的主要成分，主要由胶原、弹性蛋白、非胶原糖蛋白及蛋白多糖等组成。它与细胞黏合在一起并交织成有序的网状，赋予斑块的完整性。细胞外基质的含量、厚度及强度对于防止斑块破裂至关重要。NE除分解弹性蛋白外，还能分解连接组织的其他成分，如胶原蛋白、纤维连接蛋白。而且还能诱导细胞因子的表达，如白细胞介素-8（IL-8）、粒细胞刺激因子β、血小板生长因子和内皮素，而这些物质又能吸引和激活中性粒细胞释放更多的NE。NE的这些多重效应构成了一个级联(cascade)的网络而形成恶性循环。

以上形成的恶性循环使细胞外基质过度降解，斑块趋于不稳定，在临床表现为不稳定性心绞痛（UAP）、急性心肌梗死（AMI）甚至猝死发生。研究发现不稳定斑块具有纤维帽薄、脂质丰富、斑块内炎症反应活跃的特点，容易破裂及血栓形成，引起急性冠状动脉综合征（ACS）。炎症细胞对不稳定斑块的侵蚀可能是引起ACS的机制。及时识别不稳定斑块，并积极治疗可望减少ACS的发生。所以我们对NE的检测具有非常重要的作用。

目前中性粒细胞弹性蛋白酶检测的方法有：酶联免疫法等。酶联免疫法采用的酶为辣根过氧化物酶，采用辣根过氧化物酶主要缺点为：鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被H2O2氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定，要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。本发明采用吖啶酯标记，具有如下优点：①背景发光低，信噪比高，发光反应干扰因素少；②闪光型发光，光释放快速集中、发光效率高、发光强度大；③吖啶酯分子量小，避免遮蔽抗体结合位点，提高系统整体灵敏度；④易于与蛋白质联结且联结后光子产率不减少；⑤标记物稳定，不受环境氧化剂的影响(在2-8℃下可保存数月之久)。因此吖啶取代物是一类非常有效的化学发光标记物。

本发明采用的方法为化学发光法，其优点为：灵敏度高、特异性强、准确快速、检测时间短、线性范围宽，检测结果具有更高的准确性与重复性。

发明内容

本发明提供了一种具有较高灵敏度和特异性的检测中性粒细胞弹性蛋白酶的试剂盒。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种中性粒细胞弹性蛋白酶的化学发光检测试剂盒及制备方法，本发明所提供的化学发光法检测中性粒细胞弹性蛋白酶的试剂盒，采取磁微粒偶联中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）捕获抗体，吖啶酯标记中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）检测抗体。试剂盒还包括中性粒细胞弹性蛋白酶校准品、化学发光预激发液A、化学发光激发液B以及清洗液。