[发明专利]提高分泌型蛋白的成熟肽产生的方法

说明书

本申请提供了用于表达成熟肽的融合蛋白以及编码所述融合蛋白的核酸分子、产生所述融合蛋白或成熟肽的方法。

技术领域

本申请大体上涉及生物工程领域。具体而言，本申请提供了提高分泌型蛋白的成熟肽产生的方法，其中通过改造包含前导肽和成熟肽的前体蛋白的结构来提高成熟肽的产生。

背景技术

在生物学领域中，一些分泌型蛋白在细胞内最初表达时为包含前导肽和成熟肽的前体蛋白，随后在胞外分泌的过程中，前导肽被切除，成熟肽被分泌至胞外并发挥生物学作用。

例如，米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor mieheilipase,RML)是分泌型蛋白中的一种，其具有较强sn-1,3选择性以及高活力的特性，已被广泛用于结构脂质的酶法合成，如SOS、OPO、DAG的合成，处理鱼油富集DHA等多不饱和脂肪酸以及手性医药中间体及某些生物材料的制备。

天然的米黑根毛霉脂肪酶产量低、成分不稳定，提取困难，使得其无法工业化生产。因此，针对米黑根毛霉脂肪酶的研究主要集中在其酶学性质、应用范围以及在基因工程菌中的高效表达。1988年，诺维信公司的Boel和Huge-jensen确定了编码米黑根毛霉脂肪酶的cDNA序列，并确定米黑根毛霉脂肪酶前体蛋白是由米黑根毛霉脂肪酶成熟肽、70个氨基酸残基的前体肽及24个氨基酸残基的信号肽构成，通过酶切割前体蛋白的MET-SER之间的肽键而得到269个氨基酸残基的米黑根毛霉脂肪酶成熟肽。1989，Huge-jensen将米黑根毛霉脂肪酶的前体蛋白基因插入米曲霉的载体中，利用α-淀粉酶基因的启动子和糖化酶的终止子进行表达得到胞外分泌的rRML。利用该表达载体得到的rRML中有70％的N-端氨基酸序列与天然酶一致，而另外的30％的重组酶比天然酶少一个丝苏氨酸残基。此外，重组酶的等电点为4.3，其与米黑根毛霉脂肪酶一致，含糖量为1.2％，免疫性质也与天然酶高度相似。目前诺维信公司市场上销售的米黑根毛霉脂肪酶也是利用基因工程技术以米曲霉为载体表达的基因改性脂肪酶，液体酶商品名为20000L，固定化酶商品名为LipozymeRM IM。然而，尽管真菌米曲霉是一种优良的表达载体，但其自身会分泌各种非目标蛋白，例如：在诺维信的Lipozyme RM的酶液中，非目的蛋白淀粉酶的含量远高于目的蛋白RML，此外，还有很多其他杂蛋白如蛋白酶等，这导致其应用受到很大限制。目前，尽管诺维信将RML液体经过再次提纯，获得商品名为388的RML，但因其价格昂贵，进一步限制了其在工业中的应用。

因此，对于分泌型蛋白(例如米黑根毛霉脂肪酶)的基因工程制备方法的改进是本领域迫切需要的。

发明概述

第一方面，本申请提供了融合蛋白，其包含第一前导肽部分、柔性肽接头和成熟肽部分。在一些实施方案中，第一前导肽部分、柔性肽接头和成熟肽部分沿融合蛋白的N端至C端的方向存在于融合蛋白。

在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含位于第一前导肽部分的N端侧的信号肽。

在一些实施方案中，柔性肽接头和成熟肽之间包括第一酶切位点。

在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含第二前导肽部分，第二前导肽部分位于第一前导肽部分和成熟肽部分之间。第一前导肽部分和第二前导肽部分可以相同或不同，优选相同。

在一些实施方案中，第二前导肽部分位于第一前导肽部分和柔性肽接头之间。

在一些实施方案中，第一前导肽部分和第二前导肽部分之间包括第二酶切位点。