[发明专利]一种复合细胞制剂、制备方法及其用途

权利要求书

1.一种复合细胞制剂，其特征在于，其包含：自体富血小板血浆PRP、自体脂肪干细胞ADSCs和ADSCs来源的内皮祖细胞EPCs，以含2%CaCl₂的生理盐水分别重悬ADSCs和EPCs，调整细胞密度至2x10⁷/mL，再按体积比1：1与PRP混匀，静置20分钟，得到所述复合细胞制剂。

2.制备权利要求1所述复合细胞制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.由皮下脂肪分离出脂肪细胞；

S2.脂肪细胞经ADSCs培养基培养得到P2代自体ADSCs；

S3.所述P2代自体ADSCs经EPCs培养基培养得到P0代ADSCs来源的EPCs；

S4.由受者自身抗凝外周血经过离心得到PRP。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以ADSCs培养基重悬P2代自体ADSCs，接种至培养器皿中培养，换EPCs培养基培养6天收获P0代ADSCs来源的EPCs。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S4进一步包括如下步骤：由受者自身抗凝外周血离心收取上清及部分红细胞；再次离心弃去上部上清，收取中间层和红细胞层上部白膜层。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S1进一步包括如下步骤，剔除腹部皮下脂肪的小血管和结缔组织，剪碎呈流体状，以含硫酸庆大霉素的医用生理盐水重悬，离心取脂肪层和沉淀层，以消化液消化，经水浴和充分振荡后去悬浮絮状物，经筛网过滤，收集滤液，滤液离心弃上清，以PBS重悬，静置后吸弃悬浮物，再次离心弃上清。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S2进一步包括如下步骤，以ADSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度后接种至培养器皿中，于37 ℃，5%CO₂培养箱内培养至70-80%汇合时收获；收获时加入胰蛋白酶溶液室温消化5分钟，加入抑肽酶溶液终止消化；离心弃上清，收获沉淀物；沉淀物经洗涤和细胞筛过滤，收集滤液；滤液离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代自体ADSCs；P0代自体ADSCs传代培养至P2代收获。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述于37 ℃，5%CO₂培养箱内培养至70-80%汇合时收获的具体操作方法为，24小时半量换液，36小时半量换液，48小时全换液，以后隔天换液，至70-80%汇合。

8.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，所述ADSCs培养基为含有Ultroser G serum substitute的UltraCULTURE；所述EPCs培养基为含有以下成分的DMEM/F12：无动物源成分血清替代品、地塞米松、重组人血管内皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1。