[发明专利]一种miRNA超敏检测用探针液体芯片的制备及应用

说明书

本发明公开了一种miRNA超敏检测用探针液体芯片的制备及应用，其基本原理是一种基于金属纳米阵列上的局域表面等离子体共振效应的光学生物传感器,所述miRNA快速超敏检测用探针制备步骤如下：S1，LNA探针序列修饰；S2，纳米金属阵列排布；S3，LNA探针序列双硫基还原；S4，LNA探针锚定。本发明提供一种miRNA、快速超敏检测用探针的制备方法及应用，检测灵敏度高，可再生使用，使用寿命长。

技术领域

本发明涉及miRNA检测技术领域，尤其是涉及一种miRNA超敏检测用探针液体芯片的制备及应用。

背景技术

小分子核糖核酸（miRNA）是指一系列小的非编码的18～25个碱基的核糖核酸，它在包括人类绝大多数真核生物中表达，是控制基因表达的关键因素之一。并且成为了诊断中潜在的生物标志物和治疗中的目标。细胞内的miRNA表达水平非常低，并且体内的环境非常复杂，实现活细胞内的miRNA原位监控和追踪一直面临着挑战。目前很多基于酶辅助循环扩增的信号放大方法被开发出来了，包括双链特异性核酸酶（DSN）循环扩增，茎环辅助等温扩增（LAMP），基于EXO III的循环扩增，滚环扩增（RCA），发夹辅助二次酶扩增（HDEA）。这些信号放大方法实现了多个信号输出的目的（靶标和信号探针比例为1:N，甚至1:N2），能够检测从细胞、尿液或组织样品中提取的微量miRNA。然而，大多数方法需要复杂而精细的探针设计过程，得不到广泛地应用。更重要的是，目前很多检测策略中使用的探针都需要修饰荧光基团和淬灭团，不仅带来了化学合成步骤多的工作，而且需要精确设计荧光团和淬灭团之间的距离，从而也限制了在体内miRNA追踪中的应用。在上述方法中，荧光素作为信号输出，存在一个重要的问题，光漂白现象很严重，尤其在激光共聚焦观察过程中，不利于活细胞内长时间的观察。因此，迫切需要开发一种设计简单和抗光漂白能力强的探针，来用于活细胞内miRNA原位成像。尤其目前的方法不但繁琐复杂，需要高度技术化人员操作，而且需时往往以天计，根本无法实现床边快速诊断的要求。

开发一种能快速直接测定miRNA且可循环再用的探针液体芯片，为目前miRNA实现快速检测的重要研究课题。

发明内容

本发明创造的目的在于提供一种可快速检测miRNA且可循环再用的探针液体检测芯片。而且,通过在待检测液体样品滴加入口处分出多个微流道，各个微流道内预埋针对不同检测靶标序列的探针，一次加样就可实现多靶标同时检测。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种miRNA快速超敏检测用探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1，LNA探针序列修饰：miRNA捕获探针序列引入锁链核酸LNA捕获探针序列，所述miRNA捕获探针序列的末端修饰了双硫键，即得含双硫基序列修饰的LNA探针序列溶液；miRNA捕获探针序列的碱基引入锁链核酸LNA可以提高探针与miRNA结合的灵敏度和稳定性，锁链核酸LNA的3'末端修饰了双硫键，提高锁链核酸LNA结合在贵金属材料表面的稳定性。

S2，纳米金属阵列排布：所述纳米金属阵列由将贵金属加工成带有纳米尺寸尖端或间隙的结构阵列排列组成，所述纳米金属阵列按照固定行间距和列间距分布排列，所述行间距范围为50～1000nm，所述列间距范围为50～1000nm；纳米金属行间距和列间距均小于50nm时会增加制作成本，纳米金属行均距和列间距大于1000nm时会由于间距过大导致LNA探针序列与纳米金属结合密度降低从而降低样品可结合浓度以及增加待检测样品消耗，降低检测响应度。

S3，LNA探针序列双硫基还原：将步骤S1制备的含双硫基序列修饰的LNA探针序列溶液与3（2-羧乙基）膦盐酸盐TCEP溶液混合后，将LNA探针中的双硫基还原成巯基，即得含巯基的LNA探针序列溶液；通过3（2-羧乙基）膦盐酸盐TCEP溶液将LNA探针溶液的双硫基还原成巯基可提高探针在纳米金属表面固定结合率和固定稳定性。