[发明专利]检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组、试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组、试剂盒及应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)为圆环病毒科圆环病毒属重要成员。2016年以前，人们通常认为猪圆环病毒包括两个基因型，即PCV1和PCV2。PCV1是从猪肾上皮细胞系(PK-15)中发现，对猪无致病性。而PCV2则是严重危害养猪业的病原体之一，与PCV2相关的疾病包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、呼吸系统疾病、繁殖障碍和肠道疾病等。

2016年，Phan T.G.等报道了圆环病毒新的基因型-猪圆环病毒3型(PCV3)在美国的流行，后续在我国湖北、广东某些发生繁殖障碍母猪以及急性死亡仔猪体内也检测出PCV3。截至目前，我国已有13个省猪场存在PCV3感染与流行，且主要分布于中东部地区。PCV3感染可导致母猪出现厌食症状，皮肤出现多灶性丘疹、斑点和浅表性皮炎，生产性能下降；妊娠母猪发生繁殖障碍，产弱胎、死胎、木乃伊胎和弱仔猪，病情严重甚至造成急性死亡。不同胎龄胎儿均可发生流产。

由于PCV3具有传播途径多、传播速度快、流行范围广、危害严重等特点，因此尽快研发适用于出入境口岸与兽医临床的PCV3快速检测试剂盒显得十分必要。目前，PCV3的检测包括DNA测序、中和试验、免疫组化和荧光定量PCR等技术。然而，这些技术在应用过程中或熟练的操作人员，或需要昂贵的仪器设备，不适合在出入境口岸或兽医基层进行广泛的推广应用。环介导等温核酸扩增(LAMP)技术作为一种新颖的恒温核酸扩增方法，具有操作简便、高特异性、高敏感性等特点，近年来已被广泛应用于病原体检测。为了方便结果判别，通常在LAMP反应体系中加入金属离子指示剂，如钙黄绿素(黄绿色-橙红色)、羟基萘酚蓝(蓝紫色-天蓝色)等，通过反应管的颜色变化观察结果。但遗憾的是，目前这些颜色变化之间色差不大，且通常需要较长的反应时间(60min)。专利检测猪圆环病毒3型的环介导等温扩增方法的引物组(申请号：201710757261.1，申请日：2017-08-29；公开号：CN107312875A，公开日：2017-11-03)将LAMP技术应用于PCV3的检测，但该方法所需反应时间较长(60min)，且灵敏度较低(76ng/μL)，仍不能满足出入境口岸或兽医基层对快速、灵敏检测方法的基本需求。

研究表明，当DNA聚合酶将一个脱氧核糖核苷酸分子结合到新合成的DNA双链上时，会生成一个氢离子作为副产物，随着反应的进行会产生大量的氢离子，氢离子浓度的增加会使得反应体系的p H值降低。本发明基于此特性进行研究，将PH指示剂甲酚红用于LAMP反应的结果判别，并组装了猪圆环病毒3型的新型LAMP检测试剂盒。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种猪圆环病毒3型的LAMP快速检测试剂盒及应用，该试剂盒具有高特异性、高敏感性、可视化、操作方法简单的特点。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组，由外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、环引物LoopF和LoopB组成；

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

环引物LoopF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

环引物LoopB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还公开了一种检测猪圆环病毒3型的LAMP试剂盒，包括上述的检测猪圆环病毒3型的LAMP引物组。

进一步地，该试剂盒还包括(NH₄)₂SO₄溶液、KCl溶液、Tween-20溶液、甲酚红溶液、KOH溶液、甜菜碱溶液、dNTP混合物溶液、Bst WarmStart^TMDNA聚合酶、MgSO₄溶液。