[发明专利]一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法

说明书

本发明公开一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，首先通过对红曲米进行分离纯化得到红曲霉菌落，并将制得的红曲霉菌落添加到由琼脂、土豆汁、麦芽汁、乳酸、无水乙醇、硝酸钠和磷酸二氢钾制得的培养基中，制得红曲霉孢子，然后通过氯化钠无菌水对培养基进行冲洗，得到红曲霉孢子菌悬液，将红曲霉孢子菌悬液通过紫外线照射进行物理诱变后，再添加硫酸二乙酯溶液进一步诱变，最后将得到的红曲霉孢子菌悬液与大米粉混合，使得红曲菌株快速繁殖；本申请通过原子能辐射诱变的方法结合高温打堆的培育方法，有效提高了培养基中红曲菌株的繁殖速率，红曲菌株增多，代谢的莫纳克林K也递增，进而提高莫纳克林K的产量。

技术领域

本发明涉及一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法。

背景技术

生物制药是十二五规划期间国家重点鼓励发展的产业。当前癌症已成为威胁全球人类健康的一大杀手，主要治疗手段以西医方法为主，包括手术、放疗化疗等等，均具有较强的副作用。然而到现在为止，癌症依然只能靠药物控制，而新研发的抗癌功能性红曲产品与以往的抗癌类药物相比较，能在体内维持较高的血药浓度，从而提高抗癌活性。并且没有任何药物毒性，给药方便，只需口服给药，患者无需住院，提高了生活质量。抗癌功能性红曲具有显著的疗效，是一种安全、有效、天然、绿色、零毒的口服抗癌药物。

但是，目前红曲霉的发酵工艺主要有两种，即固态发酵和液态发酵。目前红曲霉生产在固态发酵和液态发酵两种方式上常用物理诱变和化学诱变，进而达到红曲菌株生产，现有的诱变方式虽然能够提高菌株产量，但是在原有的产量上增产量小，无法达到现有市场需求的数量，另外由于红曲菌株的产量不高，因此莫纳克林K的产量较低。

发明内容

有鉴于此，本发明目的是提供一种通过原子能辐射诱变的方法结合高温打堆的培育方法，可有效提高培养基中红曲菌株的产量，进而提高红曲菌株中莫纳克林K产量的红曲菌株培育方法。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种高产莫纳克林K的红曲菌株培育方法，包括以下步骤：

1)红曲霉菌种的制备，包括以下具体步骤：A、分离纯化，先将红曲米与蒸馏水按比例3∶1混合，并经过研磨机制得米浆，然后通过过滤器过滤得到菌悬液，备用；B、取具体步骤A中制得的菌悬液滴到由大豆汁制得的红曲增殖培养基中，于30℃的恒温箱内培养5-7天，再按10％的接种量进行第二次增殖培养5-7天，选取纯化后的红曲霉菌株，若不纯即可再次按10％的接种量进行第三次增殖培养5-7天，依次类推，直至分离得到纯化的红曲霉菌株，备用。

2)红曲霉菌落的斜面培养，其具体步骤为：A、培养基的制备，取琼脂13g、土豆汁450mL、麦芽汁450mL、乳酸7mL、无水乙醇100mL、硝酸钠200mL和磷酸二氢钾200mL添加到培养皿中，并与蒸馏水按2∶1混合，通过搅拌棒搅拌均匀，同时在搅拌的过程中，添加氯化钙用于将培养基的PH值调整至4.0，然后将制得的培养基置于杀菌锅内，在121℃的高温以及0.1MPa下灭菌20-25min，然后密封取出，置于30℃的恒温箱内发酵培养8-10天，制得用于接种的培养基，备用；B、红曲霉菌落接种，取步骤1)制得红曲霉菌落中的菌丝接入具体步骤A制得的培养基内，使得红曲霉菌丝在培养基内生长出红曲霉孢子，备用；

3)红曲霉诱变出发菌株及筛选，其具体步骤为：A、取20mL0.8％氯化钠无菌水从步骤2)中的培养基表面进行冲洗，使得红曲霉孢子脱离培养基，制得红曲霉孢子菌悬液，备用；B、原子能辐射诱变，将具体步骤A制得的红曲霉孢子菌悬液置于⁶⁰Co-Y射线下方40CM处进行辐射诱变，采用15万拉德诱变剂量的⁶⁰Co，并且持续辐射诱变30min，制得诱变红曲霉孢子菌悬液，备用；

4)将步骤3)经过辐射诱变后的红曲霉孢子菌悬液均匀洒在摊凉的大米粉上，通过手工翻拌2-3遍，保证红曲霉孢子菌悬液均匀分别在大米粉上，然后将接种均匀的大米粉堆在纱网下，并加铺毛毯，备用；