[发明专利]应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切优化方法

说明书

本发明涉及应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切优化方法，包括提取细胞核、酶切反应、回收DNA片段、数据预处理和可靠性检验。首先，对组织的细胞核的前期收集方法进行改进，并通过细胞核的数量，优化酶切反应条件，提高了DNase I的酶切效率。其次，采用DNase I的酶切方法与高通量方法的结合，不仅能够有效的获取正确的染色质片段，而且能够降低由于前期研磨样本产生的假阳性，能够在精准定位转录调控元件在全基因组上的结合位点，提高了临床样本的研究进程。最后，还对高通测序数据的可靠性进行检验。

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，尤其涉及应用于组织样本中染色质超敏感位点DNase I酶切优化方法。

背景技术

在上世纪八十年代初期，研究人员就发现当一个基因处于转录活性状态时，含有这个基因的染色质区域对脱氧核糖核酸酶(DNase I)降解的敏感性要比无转录活性区域高出100倍以上，即染色质对DNase I的敏感性与基因的转录有关，这个位点被称为DNase I超敏感位点，当时认为是真核生物某部分染色质处于开链或松散状态，容易被DNase I进行非特异性的降解所造成的。经过进一步研究发现具有功能的顺式作用元件，如启动子、增强子、抑制因子和绝缘子等都与DNase I超敏感位相偶联。

目前DNase-seq技术只在国外应用，并未在国内推广，并且该方法也只是用于细胞样本中，对于调控元件结合位点的研究也只限于细胞水平，没有很好的应用于临床。没有对临床样本的DNase I酶切优化方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种解决或部分解决上述问题的应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切优化方法。

为达到上述技术方案的效果，本发明的技术方案为：应用于组织样本中染色质超敏感位点DNaseI酶切优化方法，包括以下处理步骤：

步骤一：提取细胞核：

首先将收集的组织样本在冰浴中研磨成粉状；然后加入细胞核提取液并在冰上静置10分钟，细胞核提取液包括：10mM MgSO4，5mM KCl，0.5mM HEPES，1mg/L DDT，0.25wt％Triton-100，2wt％PVP40；再在冰上分别以孔径为100、50和20μm的尼龙膜过滤静置后的液体；而后将过滤后的液体在4℃下离心10分钟，除去上层清液得到悬浮物；最后将悬浮物加入到细胞核贮存液中，细胞核贮存液包括：10mM MgSO4，5mM KCl，0.5mM HEPES，1mg/L DDT；

步骤二：酶切反应：

首先在步骤一得到的液体中加入脱氧核糖核酸酶I，在37℃下孵育10分钟；然后加入与脱氧核糖核酸酶I等量的EDTA终止酶切反应；

步骤三：回收DNA片段：

首先将步骤二得到的液体加入到融化好的琼脂糖中，在55℃下孵育15分钟，琼脂糖的质量分数为1％；然后进行脉冲场电泳，条件为12小时，20～50秒切换，5v/cm，1wt％琼脂糖；再将电泳后的产物用T4DNA聚合酶缓冲液洗涤后，加入Tris缓冲液，在65℃下孵育10分钟，融化凝胶；最后回收融化凝胶中的DNA；

步骤四：数据预处理：

首先将步骤三回收的DNA进行高通量测序得到DNase-seq数据；然后将DNase-seq数据进行接头过滤后进行读段定位，将得到的读段回填到基因组序列中得到读段回填结果；

步骤五：可靠性检验：

首先，将基因组序列从第一个碱基对开始依次划分为多个长度为100bp的非重叠的连续的检验片段，并按照划分的次序对检验片段编号，检验片段的编号为由1开始的连续的正整数序列；然后，统计每个检验片段内的读段数量；最后，用公式一计算可靠因子：