[发明专利]一种食源性大豆生物活性肽Lunasin的无柱式、低成本制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种食源性大豆生物活性肽Lunasin的无柱式、低成本制备方法。本发明方法首先采用Overlapping Extension PCR方法获取Lunasin基因片段，以及在此基础上获取NpuC‑Lunasin融合片段，实现融合片段在表达载体pET26的融合表达；融合表达类弹性蛋白ELP标签和DnaE断裂内含肽的N端；最后利用断裂内含肽的反式剪接和ELP的可逆循环相变，实现简单、快速、无柱式、低成本分离纯化天然N端的重组Lunasin多肽，为将来Lunasin在功能食品、保健品、生物医药等领域的开发利用奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种食源性大豆生物活性肽Lunasin的无柱式、低成本制备方法。

背景技术

Lunasin(露那辛)是来源于大豆的含有43个氨基酸的生物活性肽，最早由日本新泻大学医学部小组成员于1987年在从大豆种子中分离鉴定而来。近年来研究表明该活性肽具有抑制细胞增殖的作用。Lunasin含有一个细胞粘附序列Arg-Gly-Asp(RGD)，此序列可与细胞外基质相连，导致Lunasin内化进入细胞核，Lunasin的C末端含有8个天门冬氨酸残基,可以结合到去乙酰化的染色质区(如,着丝粒),导致着丝粒复合体不能正确形成，而使微管不能捕捉到着丝粒,从而导致有丝分裂中止，抑制了细胞有丝分裂的发生。另外，最新的研究表明， Lunasin还具有通过抑制NF-КB信号通路而抑制炎症的发生。因此，作为食源性的大豆生物活性肽Lunasin，不仅可为机体提供生长发育所需的蛋白质营养，而且由于其潜在的抑制细胞增殖、抗癌、抗炎等生物学活性，将来可在功能食品、保健品、生物医药等领域具有很好的开发前景。

然而目前Lunasin的获取通常利用层析等分离手段从大豆中获得，这种方法操作繁琐，步骤复杂，重复性差，成本昂贵，不利于工业化生产。另外一种方法为化学合成，化学合成手段虽然增加了产物的纯度，但成本昂贵，仅适合于实验室基础的研究。除此之外，采用基因工程手段制备Lunasin的方法，虽然可以在大肠杆菌获得大量的重组Lunasin蛋白，但在纯化阶段都要利用亲和层析的方法，并且所获的重组蛋白，往往带有纯化标签，为非天然N端的蛋白，这往往对其生物学活性以及免疫反应造成影响。探索一种简易快捷且成本较低的方法获取天然N端Lunasin对于其开发利用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是建立了一整套lunasin原核重组表达与纯化的体系，采用无柱纯化系统，提供一种食源性大豆生物活性肽Lunasin的无柱式、低成本制备方法。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种食源性大豆生物活性肽Lunasin的无柱式、低成本制备方法：首先采用Overlapping Extension PCR方法获取Lunasin基因片段，以及在此基础上获取NpuC-Lunasin融合片段，实现融合片段在表达载体pET26的融合表达；融合表达类弹性蛋白ELP标签和DnaE断裂内含肽的N端；最后利用断裂内含肽的反式剪接和ELP的可逆循环相变，实现简单、快速、无柱式、低成本分离纯化天然N端的重组Lunasin多肽。

上述制备方法具体步骤如下：

1.lunasin基因的获得

上下游引物如下：

上游引物：

5-TCTAAATGGCAGCACCAGCAGGACTCTTGCCGTAAACAGCTGCAGGGTGTTAACCTGACCCCGTGCGAAAAACACATC-3

下游引物：

5-TTACTAGTCATCGTCATCGTCATCGTCATCGTCACCACGACCCTGGATTTTTTCCATGATGTGTTTTTCGCACGGGGTC-3