[发明专利]长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-2、制备方法及应用

说明书

本发明公开一种长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP‑2，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。制备方法依次按照如下步骤进行：用引物P1和P2对长牡蛎CgDM9CP‑2基因编码区片段进行PCR扩增；将PCR扩增产物与pET‑30a载体经Nde1和Xho1酶切后通过连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；将上述重组子转入大肠杆菌Transetta（DE3）表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白。长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP‑2可应用于制备抑制毕赤酵母菌药物。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-2、制备方法及应用。

背景技术

长牡蛎是一种重要的海水养殖贝类。由于长牡蛎缺乏适应性免疫防御系统，主要依赖固有免疫系统抵御外源病原微生物的侵染，因此细菌、真菌和病毒引起的多种疾病在长牡蛎的养殖群体中不断爆发，造成了巨大的经济损失。包含DM9结构域的蛋白首先在果蝇中被发现。之后，Magalhaes等在鱼类中发现了一些具有DM9结构域的毒素，并将其命名为“natterin”，此类毒素含有N-端的DM9结构域和C-端毒素/细菌毒素（ETX/MTX2）结构域。natterin可以在人体组织中产生细胞毒性作用，从而导致细胞坏死、水肿、局部疼痛等现象。最新的研究表明，natterin具有穿孔素的功能。近几十年中，越来越多的含有DM9结构域的蛋白质（DM9CPs）在包括节肢动物、扁形动物等无脊椎动物中被发现，并且证明DM9CPs参与机体的免疫反应。例如，在冈比亚按蚊中，一种名为“引起疟原虫唾液腺反应”的DM9CPs(PRS1) ，唾液腺侧叶上的表达量在疟原虫入侵后显著升高，并随感染孢子虫数量的增加而增加。

但是，迄今为止并没有关于长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-2、制备方法及在制备抑制毕赤酵母菌药物中应用的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-2、制备方法及应用。

本发明的技术解决方案是：一种长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-2，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种上述长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-2的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 用引物P1和P2对长牡蛎CgDM9CP-2基因编码区片段进行PCR扩增；

b. 将PCR扩增产物与pET-30a载体经Nde1和Xho1酶切后通过连接酶连接，转化，测序鉴定重组子；

c. 将上述重组子转入大肠杆菌Transetta（DE3）表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的重组蛋白。

一种上述长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-2在制备抑制毕赤酵母菌药物中的应用。

本发明利用体外重组表达技术获得了长牡蛎含DM9结构域的蛋白CgDM9CP-2，该重组蛋白具有结合Mannose、LPS和PGN的生物学活性，同时在机体外对毕赤酵母菌具有较强的抑制作用。本发明的长牡蛎含DM9结构域的蛋白CgDM9CP-2作为一种有效的模式识别受体，在制备抗菌类药物、新型免疫制剂以及饲料添加剂等方面具有应用价值。

附图说明

图1是本发明长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-2与LPS、PGN、Mannose的结合活性示意图。