[发明专利]一种具有蛋白酶活性的多肽及其应用

说明书

本发明提供了一种具有蛋白酶活性的多肽以及含有该多肽的编码核苷酸序列的构建体、载体、宿主细胞；更重要的是，本发明公开了一种含有多肽的试剂盒以及该具有蛋白酶活性的多肽在切割融合蛋白标签中的应用。该多肽具有高度的酶切序列专一性，可以作为一种专门用于特异性切除重组表达蛋白的标签的工具酶。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种具有蛋白酶活性的多肽及其在蛋白切割，尤其是融合蛋白标签切除中的用途。

背景技术

蛋白标签(Proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。同时将目的蛋白和融合标签进行融合表达是提高蛋白可溶性、增加蛋白表达量，并且有利于分离纯化的有效方法之一。融合蛋白在纯化后，通过蛋白酶的酶切而使目的蛋白和融合标签相分离而释放目的蛋白，因此随着蛋白标签的不断发展，切除蛋白标签的酶供不应求。

烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease，TEV蛋白酶)，酶切位点Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln/Gly(Invitrogen–LifeTechnologies)，是来源于烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus，TEV)的Nla蛋白酶经改进后的50kDa的蛋白酶，经过设计后与天然TEV蛋白酶相比其稳定性更好。此蛋白酶常被用来切除纯化后融合蛋白的亲和标签。TEV蛋白酶具有很强的位点特异性，能够识别EXXYXQ(G/S)的七氨基酸序列(其中X是任意氨基酸)，最普通的是ENLYFQG(Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly)，其切割位点在谷氨酰胺和甘氨酸或丝氨酸之间。蛋白酶在G/S(或P1)位点切割多种氨基酸序列，为切割后C端融合部分提供一个想要的N端氨基酸。在pH 7.0，30℃时可达到最佳活性，但在pH 5.5-8.5和4-30℃的广泛范围内TEV蛋白酶皆有活性，使得反应条件的选择可根据目的蛋白的情况而修改。切割后也很容易利用其N端的HQ标签进行TEV蛋白酶清除。也可以从固定在树脂上的融合蛋白切除掉目的蛋白。

PreScission(Amersham-Biosciences)是一种由人鼻病毒14型的3C蛋白酶和GST组成的融合蛋白。这种蛋白酶特异识别短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln/Gly-Pro中的Gln和Gly残基而进行切割，底物的识别和切割不仅依赖于融合蛋白的一级结构还依赖于融合蛋白的二级和三级结构。它可以特异性的将pGEX-6P系列等载体表达出的带有酶底物识别多肽序列融合蛋白的GST标签进行分离。

TAGZyme：His-tag removal by Exoproteolytic Digestion系统的主要组成部分，是一种外切蛋白酶——二肽氨基肽酶Ⅰ(dipeptidyl aminopeptidase I，DAPase)，如果表达的外源蛋白不含有外切酶识别的停顿位点，那么还需要联合使用谷氨酸循环转移酶(glutamine cyclotransferase Qcyclase)和焦谷氨酸氨基肽酶(pyroglutamyl aminopeptidasep GAPase)(Intein Site dithiothreitol cleavage)。这些酶都经过重组可以通过Ni-NTA填料除去。应用TAGZyme系统的反应是十分灵敏的，不会存在有内切的现象，并且切割效率高，一些灵敏的蛋白可以在4℃进行反应，最大程度地防止了蛋白的降解。这个系列有两个载体，当外源蛋白不含有DAPase停顿位点时，可以使用TAGZyme pQE-1，它可以在外源蛋白前面人工加入停顿位点谷氨酸残基，之后利用Qcyclase将它转成焦谷氨酸成为一个外切酶的停顿位点。对于那些外源蛋白中已经含有外切酶停顿位点的可以选用TAGZyme pQE-2。