[发明专利]雄蚕蛾外泌体的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种雄蚕蛾外泌体的制备方法及其应用，属于生物技术领域。本发明采用健康雄蚕蛾活体制成匀浆，差速离心分离、低温超速纯化获得高纯度的外泌体，动物皮肤损伤实验疗效良好，且外泌体可以制成冻干粉，长期保存，与不同辅料配合形成不同的制剂产品，具有极佳的市场前景和临床价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及从健康活体雄蚕蛾中提取获得具有生物活性的外泌体及其应用。

背景技术

雄蚕蛾早在唐宋时期就被皇帝们作为一种珍贵的补肾、抗衰老、延生益寿的常用补品；明朝著名医药学家李时珍在《本草纲目》中称雄蚕蛾为神虫国宝，说此虫具有补肝肾、壮阳、抗衰老、预防老年痴呆、预防男性前列腺增生、调节女性内分泌失调等都有明显效果。市面上可以见到琳琅满目的雄蚕蛾补肾壮阳产品，但未见治疗创伤、溃疡和烫伤等症的产品，原因可能是治疗创伤的有效成分在制成雄蚕蛾干体时被破坏活丢失。

近年来研究发现外泌体是细胞主动分泌的直径在40-100nm，密度在1.10-1.18g/ml的囊泡小体，广泛存在于活体动物、植物、微生物体内。外泌体内选择性包裹脂质、蛋白质、mRNA及miRNA等多种生物活性物质，膜表面携带宿主的某些表面标记，可以通过配受体结合等方式被靶细胞摄取，并具有明确的减轻组织损伤程度、促进损伤组织形态学及功能学修复的作用，它可能还具有潜在的调节机体免疫、调控细胞生长分化等生物学功能。

目前提取外泌体的方法较多，如1.超速离心法(差速离心)：是采用低速离心、高速离心交替进行，分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎。2、密度梯度离心法：在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集。但步骤繁琐，耗时。3.磁珠免疫法：外泌体表面有其特异性标记物(如CD63、CD9蛋白)，用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。4.试剂盒提取法：市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。这些试剂盒不需要特殊设备，随着产品不断更新换代，提取效率和纯化效果逐渐提高但目前缺乏针对昆虫外泌体提取的试剂盒。因此超速离心法是适合工业化生产的最常用的外泌体纯化手段。

发明内容

本发明的目的在于提供雄蚕蛾外泌体的制备方法及其应用，发明人采用健康雄蚕蛾活体制成匀浆，差速离心分离、低温超速纯化获得高纯度的外泌体，在动物皮肤损伤实验治疗中，取得了良好的疗效，且外泌体可以制成冻干粉，长期保存。与不同辅料配合形成不同的制剂产品。

经过大量试验和不懈努力，发明人获得了如下的技术方案：一种雄蚕蛾外泌体的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)取健康雄蚕蛾活体用生理盐水或PBS浸泡，组织匀浆机打碎制成匀浆，匀浆500-1000g离心30min，收集上清液，沉淀部分另作他用；

(2)取步骤(1)的上清液10000-12000g离心100min，收集上清液，沉淀部分另作他用；

(3)取步骤(2)的上清液100000g离心100min，弃上清液，收集沉淀；

(4)取步骤(3)的沉淀加入PBS重混后，120000g离心120min，弃上清液，收集沉淀，沉淀用PBS混悬；

(5)步骤(4)的PBS混悬液中加入甘露醇至终浓度为10％，混匀后滤膜过滤；