[发明专利]一种重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗，该病毒颗粒疫苗可用于预防鸡球虫病，同时还公开了重组鸡球虫甲病毒颗粒制备方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

鸡球虫病是由孢子虫纲(Sporozoa)、艾美耳科(Eimeriidae)、艾美耳属(Eimeria)的球虫引起的一种寄生在鸡肠道的寄生性原虫病。该病呈世界性分布、感染率高、危害性大。感染球虫的雏鸡生长发育迟缓、精神萎靡、羽毛逆立，严重时导致雏鸡死亡，死亡率能达到20%-80%。成年鸡多为带虫者，出现生长迟缓、羽毛逆立、产蛋率下降等病症。据不完全统计，每年仅鸡球虫病一项在世界范围内造成的经济损失就高达30亿美元以上。

目前防治鸡球虫病主要依靠药物，然而长期依靠药物防治并非长久之计。首先是耐药性的问题，诸如经典的地克珠利、盐霉素、磺胺喹恶林、磺胺氯吡嗪、磺胺二甲氧嘧啶等药物均已出现高度耐药；其次是药物残留问题，养鸡场违背农业部停药期规定长期滥用抗球虫药，导致的结果就是肉蛋产品药物残留超标，严重危害人类食品健康安全；最后是养鸡厂为检测耐药性和大量使用抗球虫药以及药厂研发新的抗球虫药所带来的成本增加。受以上这些因素影响，目前国内外已有越来越多的兽药制药公司从防治球虫病药物的领域撤出，现阶段已有多年未见新的化学合成抗球虫药问世。

药物防治存在的诸多弊端，使得研究人员把目光转向疫苗领域，以期通过疫苗免疫的途径来达到预防鸡球虫病的目的。

现阶段研究的较多的疫苗大体上可分为三类：活苗、亚单位疫苗和DNA疫苗。活苗制备工艺复杂、运输不便，且存在散毒和毒力返强等缺点，不适合大型集约化养殖条件下的多层笼养模式，因此活苗要想大规模推广难度巨大；亚单位疫苗存在着保护蛋白表达量低、修饰困难、免疫原性较低的缺陷，也不能提供强有力的抗球虫保护作用；DNA疫苗相比传统的疫苗安全性好，本身不会散毒或产生毒素引发其它疾病，但DNA疫苗也存在着诸多问题：如常规真核表达载体表达量低、抗原免疫原性弱以及外源基因与宿主基因整合导致突变等，因此DNA疫苗目前也仅处于实验室研究阶段，并未商品化。而甲病毒载体的出现，为解决以上问题提供了很好的思路。

甲病毒(Alphavirus)属于披膜病毒科(Togavirus family)，遗传物质是单股正链RNA，其基因组的大小约为12kb，有2个开放性阅读框，5^，端是甲病毒自身复制、转录所需酶和信号的非结构蛋白区，并且该端具有帽子结构和CMV强启动子，该区包含nsP1、nsP2 、nsP3和nsP4，该部分具有病毒的包装信号；3^，端为编码甲病毒的结构蛋白序列，RNA(-)在复制酶的作用下合成全基因组的RNA和亚基因组RNA，最后在亚基因组启动子的作用下翻译成病毒的衣壳蛋白(Capsid)、E1、E2、6K等结构蛋白，并且该端具有终止信号(A69)和强转录终止信号SV40poly(A)，终止信号使其正常转录及polyA(A)尾结构增强其稳定性，使其完成表达。甲病毒复制子载体导入细胞后能快速高水平地复制，研究证实SFV在细胞内的复制量能高达2×10⁵个/细胞，远超常规的真核表达载体。甲病毒复制子载体还能诱导细胞凋亡，外源基因仅在胞浆中表达后便发生凋亡被宿主细胞清理而不会整合到宿主细胞上，大大提高了疫苗的安全性。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗及制备方法，是一种包含鸡球虫Repair_PSII基因的重组甲病毒颗粒疫苗。

本发明所述的一种重组鸡球虫甲病毒颗粒疫苗及制备方法，其的技术解决方案如下：

包装成含鸡球虫Repair_PSII基因的重组甲病毒颗粒，首先必须获得能传递和表达该基因的重组质粒pSMART2b-Repair_PSII，且需证实其构建正确及能够表达。接着将重组质粒pSMART2b-Repair_PSII与辅助质粒pSHCAR转染入甲病毒的宿主细胞（如293细胞），然后收集病毒原液并感染BHK-21细胞，最后得到含鸡球虫Repair_PSII基因的重组甲病毒颗粒疫苗。

1、重组质粒pSMART2b-Repair_PSII的构建及表达