[发明专利]一种线粒体相关药物性耳聋基因突变检测的引物和方法

说明书

技术领域

本发明属于医学及生物技术领域，具体涉及检测线粒体mtDNA 12S rRNA基因突变情况的引物和方法，所述基因为线粒体相关药物性耳聋基因。

背景技术

耳聋是导致言语交流障碍最常见的疾病。在中国，听障人群超过2千万，儿童患者约80万，且每年新发耳聋患儿8万名。这些患者大都患有严重影响交流且治疗困难的感音神经性耳聋，其中遗传因素所致耳聋占50％以上。有遗传因素引起的耳聋包括综合征型耳聋(占30％)和非综合征型耳聋(占70％)其突变主要包括GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体12S rRNA。调查显示耳聋患者中3.4％是由个体体质敏感使用了耳毒性药物而引起，药物性耳聋，是药物使用不当产生的毒副作用所造成，又称为药物中毒性耳聋，是药物中毒比较严重和常见的一种。耳毒性药物如氨基糖苷类抗生素等。目前研究已证实，线粒体12s rRNA中A1555G和C1494T是氨基糖苷类抗生素致聋基因突变。Lu等通过对1642例氨基糖苷类诱导性耳聋和非综合征耳聋的儿童进行调查研究，发现A1555G和C1494T的突变频率分别为3.96％和0.18％，此外还发现一部分A1555G突变患者即使不接触氨基糖苷类药物，同样会产生感音神经性耳聋。

在我国，氨基糖苷类抗生素使用不当，是最常见的药物致聋的原因。氨基糖甙类药物包括庆大霉素、链霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素和巴龙霉素等等，主要由链霉素和小单孢菌产生，在临床上用于治疗革兰氏阴性菌引起的感染和结核杆菌感染，其药物作用机理是直接与细菌的16S rRNA结合，导致细菌蛋白翻译错误或者蛋白质合成提前终止而达到抗菌效果。分析显示，人类12S rRNA如果携带有A1555G和C1494T突变，会使12S rRNA的二级结构发生与细菌16S rRNA相同的变化，致使氨基糖甙类抗生素与12S rRNA结合导致人体耳细胞线粒体蛋白质合成异常，使得氧化磷酸化过程受阻而影响ATP的合成；由于内耳的离子梯度是依靠消耗ATP的离子泵来维持，所以耳蜗内ATP的减少会导致血管纹、内淋巴液、毛细胞内的离子浓度不平衡，最终导致毛细胞的死亡，诱导耳聋的发生，造成听力受损。A1555G和C1494T突变位点对氨基糖苷类药物的毒副作用极其敏感，可以引起耳蜗、前庭等关键性听力器官发生严重“病变”，导致不可挽回的损害。

由于携带与未携带此类药物致聋基因的孩子在表型上并无区别，想要孩子避免不当使用氨基糖苷类抗生素，避免“一针致聋”，唯一的途径就是做基因检测，并且越早做越好。2015年10月23日，国家卫生计生委卫生发展研究中心专门就“新生儿安全用药基因筛查”项目下达文件，指出“于2015年9月～2017年9月期间，组建研究团队，在国家卫生计生委相关部门的指导支持下，开展基因筛查技术的评估，为国家应用和推广有关技术提供相关证据支持。”而药物性致聋基因检测在产前诊断和新生儿疾病筛查中具有举足轻重的作用，在临床上普及线粒体基因12S rRNA的A1555G和C1494T突变的筛查尤为重要。

由单基因纯合突变导致的耳聋在遗传性耳聋中尤为常见，临床分子诊断可以提供准确的表型预测，在国际上诸多实验室已建立了常见耳聋基因筛查方法，Sanger测序技术是临床分子诊断的金标准，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。限制性片段长度多态性技术只能对单一突变位点进行检测，如需检测多个位点，则需多次PCR，操作复杂，工作量大。变性高效液相色谱法能精准定量mtDNA 1555A＞G突变负荷，但该方法自动化程度高，设备昂贵，对技术人员要求高，使得在临床应用中受到限制，因此多用于科学研究。基因芯片同样由于试剂成本高，设备昂贵等原因，不适用与在临床广泛推广。

本发明开发的诊断方法可以广泛地应用于临床针对线粒体mtDNA 12S rRNA突变引发的耳聋的诊断和预防。从长远角度看，可以为有效减少氨基糖苷类抗生素敏感人群发生药物性耳聋的状况提供可靠、简便的检测方法，同时，也适用于全国范围内特别是欠发达地区实行母系遗传性耳聋线粒体mtDNA 12S rRNA A1555G和C1494T突变的大规模筛查和预防性检查。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测线粒体相关药物性耳聋基因突变热点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测非综合性耳聋患者体内线粒体mtDNA 12S rRNA基因多态位点的突变情况。所述检测线粒体mtDNA 12S rRNA基因多态位点突变情况的引物，其碱基序列为：

XLT–F：GGTGCTTTGTGTTAAGCTAC