[发明专利]一种定点标记的泛素特异性蛋白酶7及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种定点标记的泛素特异性蛋白酶7及其制备方法和应用，所述泛素特异性蛋白酶7进行定点突变后，采用带有标记基团的非天然氨基酸进行定点标记，其中，所述带有标记基团的非天然氨基酸通过tRNA合成酶/tRNA对引入；本发明通过优化蛋白表达流程，选择特定的标签及表达载体，并通过tRNA合成酶和tRNA对引入非天然氨基酸，各步骤各条件协同增效，提高了蛋白的表达量并完成了定点标记，操作简便，易于推广，不影响蛋白酶7的结构和活性，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种定点标记的泛素特异性蛋白酶7及其制备方法和应用。

背景技术

泛素广泛存在于真核生物中，在细胞生理生化过程中扮有重要作用。在各级泛素酶的催化作用下，泛素分子可以对靶蛋白进行特异性的翻译后修饰叫做泛素化。泛素化是蛋白质翻译后修饰的一个重要途径，通过2到4个级联酶特异性修饰靶蛋白的稳定性、定位和活性。与之相反，泛素化过程能被去泛素化酶逆转，称为去泛素化，即通过切除单聚和多聚泛素来对抗泛素化作用，从而提供一个额外水平的翻译后调控。去泛素化酶能特异性地水解泛素C-末端与靶蛋白之间形成的酯键、肽键或异肽键，使泛素脱离靶蛋白，从而参与调控细胞周期进程、蛋白质降解、基因表达、DNA修复及细胞凋亡等方面起着重要作用。

泛素特异性蛋白酶(ubiquitin-specific proteases，USPs)是目前已知的去泛素化酶家族中成员最多、结构最具多样性的一类，广泛参与到细胞周期、癌基因和抑癌基因等有关蛋白的调节中。异常的去泛素化活性与许多疾病有关，包括癌症。泛素特异性蛋白酶7(USP7)也称为疱疹病毒属伴随的泛素特异性的蛋白酶(Herpesvirusassociatedubiquitin specific protease，HAUSP)，是这个家族的重要成员之一。人类USP7由1102个氨基酸组成，而鼠USP7由1103个氨基酸组成，分子量约为135kDa。USP7包括四个结构域，N-氨基末端TRAF区域、催化区域及64kDa的C-羧基末端区域等三个区域现已经被鉴别出来。N-氨基末端TRAF区域负责直接与底物蛋白(如p53、MDM2等)相结合，主要影响蛋白和蛋白之间的相互作用。催化区域包含两个高度保守的组氨酸盒和半胱氨酸盒，是泛素蛋白酶家族的重要特征。泛素结合袋位于催化区，而泛素结合袋的形成，可以激活USP7，从而促使USP7与泛素相结合，起到去泛素化的作用。C-羧基末端区域含有两个泛素连接酶，能与泛素相互作用，以及5个连续的类泛素区(Ubl)。它起初作为一个单纯疱疹病毒蛋白感染的细胞蛋白0(ICP0)的绑定伴侣被鉴别出来。继而，许多潜在的底物和绑定分子被鉴别出来。其中，泛素特异性蛋白酶7的一些更具特征的底物在肿瘤抑制、DNA修复、免疫反应、病毒复制和表观遗传控制等方面有重要作用。