[发明专利]一种禽流感病毒的全悬浮培养方法

权利要求书

1.一种禽流感病毒的全悬浮培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：取EB66细胞进行生长培养；

步骤2：待EB66细胞的密度生长至适于接毒时，取禽流感种毒对步骤1所得细胞株采用流加补液的方法进行禽流感病毒的接种，按病毒液与细胞培养基按1/10000的体积比进行接种，接毒完成后，将摇瓶放回5％的CO2培养箱中进行吸附，此时轨道摇床以固定的培养转速进行振荡；吸附完成后补加病毒生产液，并放回到5％CO2培养箱中继续培养，轨道摇床以固定的培养转速进行振荡；接种病毒的第0天补加2mg/L TPCK胰酶，第1天再补加2mg/LTPCK胰酶；

步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的HA效价，在病毒HA效价达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的禽流感病毒。

2.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，还包括步骤4：取步骤3所得培养后的禽流感病毒作为下一代病毒传代培养的种毒，继续采用流加补液工艺接种至EB66细胞中进行病毒的传代驯化与增殖，并按此方法连续传代2-30代，最终收获禽流感病毒在EB66传代细胞中适应毒。

3.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，步骤1所用EB66细胞的培养方法如下：

从液氮中迅速取出EB66细胞，在37℃水浴锅中迅速融化，待EB66细胞完全融化后，将复苏细胞加入约复苏细胞30倍体积的培养基中，经离心机300g离心10min，倒掉上清液，加入培养基将细胞吹打重悬均匀，接种至三角摇瓶中，并放置于轨道摇床上进行悬浮培养，每天取样进行细胞计数并计算活率，待培养至第2-3天时，进行细胞传代，细胞经连续传代3代次以上，且细胞倍增速率稳定时，用于病毒的接种或者继续传代。

4.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，所述的EB66细胞培养箱温度为35℃-37℃；轨道摇床的培养转速为130rpm-150rpm。

5.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，当EB66细胞密度达到6×10⁶/mL-15×10⁶/mL时，用于禽流感病毒的接种。

6.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，所述细胞接毒后吸附时间为0.5h-2h，培养箱培养温度为33℃-35℃；轨道摇床的培养转速为110rpm-140rpm。

7.根据权利要求1所述的全悬浮培养方法，其特征在于，病毒接种吸附完成后，还需补加新的病毒生产培养基，补加比例为原工作培养基体积的1-3倍。