[发明专利]一种利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法。本发明所提供的利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法，包括如下步骤：将含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒克隆到里氏木霉基因组中cel3c基因的5’UTR区域。本发明实验证明在cbh1基因缺失株中，将cbh1基因的表达骨架整合入位点M29，并与野生菌株比较cbh1基因的表达水平，发现将重组基因插入该位点，可以获得优于cbh1位点的表达水平。本发明进一步丰富完善了利用里氏木霉作为宿主高效表达重组蛋白的技术方案。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法。

背景技术

丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是工业上主要的纤维素酶半纤维素酶生产菌株，是美国FDA认证的食品安全级菌株。里氏木霉具有强大的蛋白分泌能力，某些突变株的外分泌蛋白量可达100g/L，并具有与高等哺乳动物相似的糖基化系统，因此里氏木霉是一种非常理想的重组蛋白表达宿主，得到国际著名酶制剂公司(如Genencor、Novozymes等)的高度重视，并成功应用于多种药物、化学试剂以及酶制剂的表达和生产。近年来，随着里氏木霉基因组学的快速发展及其遗传操作系统的不断完善，利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白也越来越受到重视。

值得指出的是，里氏木霉中外源DNA片段多以非同源末端连接的途径NHEJ(nonhomologous end-joining)整合入基因组，呈随机插入的形式。重组蛋白的基因表达框在基因组中的不同的插入位点会直接影响到其表达水平。例如，若重组基因插入到沉默子的调控区可能直接导致其不能转录而表达失败，如果外源基因插入到增强子的调控区域也可能使其表达量大幅度提高。里氏木霉中纤维二糖水解酶基因(cbh1)的位点通常被认为是基因高效表达的位点。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法。

本发明所提供的利用里氏木霉作为宿主表达重组蛋白的方法，可包括如下步骤：将含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒克隆到里氏木霉基因组中cel3c基因(Locustag:TRIREDRAFT_82227)的5’UTR区域。

其中，所述“将含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒克隆到里氏木霉基因组中cel3c基因的5’UTR区域”可为如下任一：

(a)用所述含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒取代所述里氏木霉基因组中cel3c基因的5’UTR区域中任意片段；

(b)将所述含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒插入到所述里氏木霉基因组中cel3c基因的5’UTR区域中的任意位置。

进一步地，所述里氏木霉基因组中cel3c基因的5’UTR区域的核苷酸序列为SEQ IDNo.1。

在本发明的实施例中，所述“将含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒克隆到里氏木霉基因组中cel3c基因的5’UTR区域”具体为：将所述含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒取代所述里氏木霉基因组中SEQ ID No.1的第141到第164位。

如同本领域的常规理解，在上述方法中，所述含有待表达的目的蛋白的编码基因的表达盒自5’端到3’端依次包含启动子、由所述启动子启动表达的所述待表达的目的蛋白的编码基因，以及终止子。当然，根据需要还可以包含其他类型的调控序列。